细菌内毒素检查标准操作规范流程.doc

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。1.2 供试品细菌毒素限值的确定。（一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；（二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算：MV D=C?L/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。2 实验材料及用具2.1 天平? 供试品称量用，精度为0.1mg以下。2.2 电热干燥箱? 除外源性内毒素用，温度应能达到250℃。2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。2.4 水银温度计或酒精度计，精度在1℃以下。2.5 旋涡混合器。2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。2.7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品。2.8 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定用的检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。2.9 实验用具? 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm 须经250℃ ，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素? 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃ 源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开包装的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则再次干烤除去可能存在的 外源性内毒素。4 凝胶法操作方法4.1鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否正确，也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。4.1.1 实验操作4.1.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶 液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品，为一次性使用。4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入