Cu,Zn-SOD的理性设计及热稳定性研究.pdf

摘要 摘要 (Superoxidedismutase) SOD SOD 超氧化物歧化酶 又被称为肝蛋白，简称为 。 是超氧阴 离子自由基(O  )的专一性清除剂，能够预防和治疗超氧阴离子引起的多种疾病如风湿性关 2 节炎、肺气肿、老年性白内障等。目前，SOD 除了药用外已被添加至多种食品和化妆品中 来作为保健品及延缓衰老。因此，SOD 是很有前途的一种蛋白酶，有着非常广泛的应用前 景。但是由于天然SOD 在体内具有许多缺点如：停滞期短、不稳定、免疫原性、易于被 蛋白酶水解等，从而影响到大规模生产及广泛的应用。因此，为了克服上述缺陷，设计开 发出活性高、稳定性强的新型SOD 就非常必要。 本课题主要是通过PDB(Protein DataBank)数据库得到小鼠的Cu,Zn-SOD 三维晶体构 象，使用Discovery Studio4.0 蛋白设计软件对Cu,Zn-SOD 蛋白质的非保守区序列进行基于 热稳定性的虚拟氨基酸突变和分子动力学模拟，根据折叠自由能的差值ΔΔGmut 变化确突变 氨基酸位点组合，并通过分子动力学模拟得到最后的突变氨基酸位点。然后通过实验的方 法构建野生型和突变型的重组表达质粒并转入大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中进行克隆和 Cu,Zn-SOD(WildType) MCu,Zn-SOD(Mutant) 表达，对表达得到的 及 的热稳定性进行验证。 本课题的主要过程及结果如下： 1. 自NCBI 获得来自猩猩、牛、羊、人等的Cu,Zn-SOD 的氨基酸序列，将以上氨基 酸序列与MusMusculus 的序列通过软件ClustalX2 进行氨基酸序列的比对，并由DNAman 分析得到小鼠Cu,Zn-SOD 的保守序列，将相对应的27个非保守氨基酸序列作为待突变的 位点； 2. PDB MusMusculus Cu,Zn-SOD 3GTT 通过 数据库获得 的 三维空间结构（登录号： ） 并载入软件Discovery Studio4.0 中，采用虚拟氨基酸定点突变技术，将Cu,Zn-SOD 中待突 变的非保守氨基酸分别突变为其他的19 种氨基酸，根据能量变化最终得到单点突变 (S-MSOD)、双点突变(D-MSOD)和三点突变(T-MSOD)的突变能变化最优的TOP5 突变体； 3. 通过对WT-SOD、S-MSOD、D-MSOD 和T-MSOD 的突变能变化最优的TOP5 突变体进行10ns分子动力学模拟，由AnalysisTrajectory模块进行分析得到RMSD、RMSF、 PotentialEnergy BondEnergy Q49W 、 等数据，从中确定最优的单点突变为： ；双点突变为： Q49W/G90I；三点突变为：V30W/Q49W/G90I； 4. 从小鼠血液中提取RNA，并通过PCR、Overlap PCR、酶切、连接、转化等步骤 pGEX6p-1-SOD pGEX6p-1-S-MSOD pGEX6p-1-D-MSOD pGEX6p-1-T- 构建重组质粒 、 、 、 MSOD； 5. 将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3）中进行诱导表达，反复冻融法破菌后对全菌 液、上清及沉淀进行SDS电泳，确定Cu,Zn-SOD 上清中在 16kD 左右处产生特异 性蛋白条带，说明Cu,Zn-SOD 有适量可溶性表达。以GST 琼脂糖为介质利用亲和层析法 II