干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测.doc

三个方向诱导分化 诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化 一、诱导方法 将细胞悬液置于 50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质) 转化生长因子β1 10ng/ml, （左旋）维生素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L) 地塞米松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L） ITS 50mg/ml 丙酮酸钠 1mmol/L 亚油酸 5.35ug/mg 牛血清白蛋白 1.25ng/ml。 倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。 细胞培养3周。去除培养液,晾干, ①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作； ②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min , 麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干， 显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。 或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测： 培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液， 10％甲醛固定lh， 自来水冲洗15min， 双蒸水冲洗1次， 滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h， 加人95％乙醇，洗去多余的染液， 烘干，中性树胶封片。 诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化 成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为 0.1 的新生牛血清 、 0.1 μmol/L 地 塞 米 松 、 50 μmol/L 抗 坏 血酸 、 10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠 的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测: ①碱性磷酸酶组织化学染色: 取成骨诱导 14 d 的细 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。 ②碱性磷酸酶活性检测: 取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。 ③钙结节染色: Von Kossa’s矿化结节染色法 原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。Van kossa银染色法试剂：1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次2. 2%硝酸银内置暗处1小时3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）5. 5%硫代硫酸钠1小时1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；2.浸入5%硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10 min，蒸馏水洗涤；3.浸入5%次亚硫酸钠3%硫代硫酸钠冲洗溶液中，蒸馏水洗；4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2，二甲苯透明，中性树胶封片。1. Sections to water. 切片脱蜡至水??2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes. 置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟5. Wash in water. 用水漂洗6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色 茜素红S中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonateCAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7?H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-