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解脲支原体dna报告单 药典附录支原体检测 中国药典2010版 附录XIIB 支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法 培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色， 盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10～10，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10～10，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3 支试管，置36 ℃ 士1 ℃ 培养7 ～14 天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 ) 应达到10 ，口腔支原体（ATCC 23714 ）应达到10。 检查法（1）供试品如在分装后24 小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8 ℃ ；超过24 小时应置一20 ℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10 ～15 分钟，冷却至56 ℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 ) ，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml 的支原体半流体培养墓（已冷至36 ℃ 士1 ℃ ）和支原体肉汤培养基各4 支，每支培养基接种供试品0.5 ～1.0ml ，置36 ℃ 士1 ℃ 培养21 天。于接种后的第7 天从4 支中取2 支进行次代培养，每1 支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2 支，置36 ℃ 士l ℃ 培养21 天，每隔3 天观察1 次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】 质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA 染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA 着色。 试剂 （1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg ，加人100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hank #39;s 平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40 分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank #39; s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml ，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3 ）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L 枸橼酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氢二钠溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混匀，调pH 值至5.5 。 -4-8-3-5-7-9 培养墓及指示细胞（1） DMEM 完全培养基。 ( 2 ) DMEM 无抗生素培养基。 ( 3 )指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞） 取培养的Vero细胞经消化后，制成每lml 含10 的细胞悬液，以每孔0.5ml 接种6 孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml ，于36℃ 士1 ℃ 、5 ％二氧化碳条件下培养过夜，备用。 供试品处理（1）细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少