兔胚染色体的简易制备技术①.pdf

遗传 HEREDITAS(Beijing)16(5):43-441994 ·实验技术与方法 · 兔 胚 染 色 体 的 简 易 制 备 技 术① 刘 林 安 民 王莉莉 (it京农业大学畜牧系动物繁殖教研室 100094) AnImprovedMethodforChromosomePreparationsofRabbit PreimplantationEmbryos LiuLin AnMin WangLili (DepartmentofAnimalScience,BeijingAgriculturalUniversity100094) 对动物早期胚胎染色体进行分析，对于早期胚胎发育、孤雌生殖发育、多倍体发育、体外受精、胚胎性别鉴 定、胚胎细胞核移植、嵌合休分析、染色体原位杂交、遗传上变异的诱发及胚胎早期流产的原因分析等研究，均 有十分重要的意义．然而，用现在的压片法或空气千燥法制备兔胚胎染色体 (4,卜，·’叼”，常存在胚胎丢失，染色体 分散不好或严重丢失，分裂相极少，或难以获得适合于分析的适度收缩长度的中期染色体等问题，成为分析胚胎染 色体的主要障碍．另外，操作繁琐、制片时间长、重复性不好也影响分析．本文对兔桑棋胚及囊胚染色体标本制 作技术进行反复多次摸索，形成了重复性好、快速、简便的兔附植前胚胎染色体标本制备方法，并对体外培养的兔 胚胎染色体组型进行了分析． 1材 料 与 方 法 1.1胚胎来源 实验动物为健康的性成熟青年大耳白兔或青紫蓝兔，超数排卵或自然发情后交配．用改良的DPBS冲洗输卵 管，收集不同成熟时期的胚胎，置含 10％小牛血清的TCM-199(Gibco）的5如1小液滴中，其上彼盖有石蜡油，于 5%CO：湿度空气、38℃培养箱中培养，至桑桩期或囊胚期，或直接从子宫中收集胚胎． 1.2胚胎染色体制备步骤 1.2.1培养 将胚胎置于含0.1pg/ml秋水仙胺 (B（oehringer）的上述50uj1培养小液滴上（覆盖液体石蜡）中培养 4小时，条件同上． 1.2.2酶消化 将胚胎移置0.25胰蛋白酶D（ifco)(pH0)或用0.5％链霉蛋白酶(Boehringer)在38℃条件下消 化5-10分钟，这时粘蛋白层完全去掉，透明带部分消化，形状变薄、膨大到适度．然后，在PBS中洗2-3次． 1.2.3低渗 在0.075mol/L氯化钾中浸洗片刻，再将胚胎移置0.2ml该低渗液中，38℃条件下低渗15分钟． 1.2.4预固定 于甲醇：冰乙酸：双蒸水(4（:1:5)预固定液中预固定5-20分钟，可见胚胎单个细胞变为透明．然后 将1枚或2枚胚胎置于洁净酸（洗）的载玻片上，所附带的预固定液尽量少． 1.2.5固定 待上述预固定液快干燥前，将3:1的甲醇：冰乙酸固定液小液滴约（50川）迅速滴置胚胎上，待固定液 快干燥、胚胎刚显现时，再加 1或2滴固定液，可见胚胎细胞散开；同时，轻轻向胚胎部分吹气，使染色体分散更 ①本文得到国家教委博士点基金的资助．宁国杰副教授给予热情指导，作者表示衷心感谢． 44 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1994 16卷 好．再置于 38C1湿度温箱中干燥． 1.2.6染色 用1:20的Giemsa原液：0.2moi/LPBS(pH=6.8)扣染15分钟，水洗、镜检及照相．上述操作主 要在体视显微镜下进行． 2结 果 与讨 论 21低渗及处理时间 欲获得分散理想的分裂相，低渗是关键．实验摸索了低渗溶液的种类及时间，发现1%,0.9%,0.8％的柠檬 酸三钠效果比0.075mol/LKCl差，而且0.075mol/LKCl低渗处理时间以巧分钟为宜包（括在低渗液中浸洗时 间）．不过，每次所用KCl溶液应新配制． 2.2秋水仙肤浓度及处理时间 为了获得既具有适度长度染色体，又F育一定数量的中期分裂相，对秋水仙胺适宜的浓度及处理时间浓（度为 1,0.4,0.1及0.05pg/ml；时间2,4,6及8小时）进行试验．结果，秋水仙胺浓度为0.lAJg/ml，处理时间为4 小时最为适宜见（图版I,1).0.4u,g/ml，处理4小时，分裂相增多，但染色体长度稍短，位于中后期较多，可做组型 分析，但