甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法.docx
DB33/T2408—2021
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甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了术语与定义、缩略语、甘薯茎腐病菌PCR反应和实时荧光PCR反应体系的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。
本标准适用于甘薯根、茎、叶等植物材料甘薯茎腐病菌的检测。2规范性引用文件
本标准没有规范性引用文件。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
甘薯茎腐病菌thepathogenofstemandrootrotofsweetpotato
引起甘薯茎腐病的病原菌，属于细菌界（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、伽玛变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales）、果胶杆菌科（Pectobacteriaceae）、狄克氏菌属（Dickeya）、达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。革兰氏阴性细菌，菌体短杆状，大小约为2.36μm×0.40μm，周生鞭毛，可在烟草上激发过敏性反应（HR）。
注：症状特征见附录A。
4缩略语
下列缩略语适用于本标准。bp：碱基对（Basepair）
CFU：菌落形成单位（Colony-FormingUnit）
CTAB：溴代十六烷基三甲胺（Cetyltrimethylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）
dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）HR：过敏性反应(HypersensitiveReaction)
MALDI-TOFMS：软电离高分辨飞行时间串联质谱仪（Matrixassistedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrometry）
NA：营养琼脂（NutrientAgar）
NGM：营养琼脂甘油培养基（NutrientAgarGlycerolMedia）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）
RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq：水生噬热杆菌（Thermusaquaticus）
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5方法原理
根据甘薯茎腐病的菌落形态特征、田间危害症状特征、分子生物学PCR或RT-PCR反应特征、蛋白质指纹图谱特征和致病性测试结果等进行检测鉴定。
6试剂或材料
6.175%乙醇。
6.21%次氯酸钠。
6.3蛋白胨。
6.4牛肉浸膏。
6.5氯化钠。
6.6琼脂粉。
6.7蔗糖。
6.8NA、NGM培养基配方，培养基配比按附录B执行。
6.9PCR凝胶电泳检测试剂，制备方法按附录C执行。
6.10实时荧光PCR检测试剂，制备方法按附录D执行。
7仪器设备
7.1普通冰箱。
7.2超低温冰箱：最低可设定温度-80℃。
7.3台式小型离心机。
7.4低温高速离心机。
7.5PCR仪。
7.6实时荧光定量PCR仪。
7.7电泳仪。
7.8水平电泳槽。
7.9凝胶成像分析仪。
7.10微波炉。
7.11电子天平：最小分度值为1mg。
7.12显微镜。
7.13恒温培养箱。
7.14超净工作台。
7.15灭菌锅。
7.16旋涡振荡器。
7.17移液器。
7.18MALDI质谱仪：需具有细菌鉴定分析模块及含D.dadantii质谱数据的菌株数据库。
8甘薯茎腐病菌检测流程
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甘薯茎腐病菌检测流程图见图1。
图1甘薯茎腐病菌检测流程图
9症状观察
对于植株样品，参见附录A中的症状描述观察有无甘薯茎腐病典型症状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的块根、藤蔓、叶柄、叶片等进行检测，无症状植株随机取样测试。
10实验室检测
10.1样品处理
10.1.1对于有症样品：取病健交界处组织置于低倍显微镜下观察有无喷菌现象（见附录A）。如观察到喷菌现象，剪取病健交界处3块～5块组织，每块约10mm×10mm，表面消毒后无菌水洗三次，剪碎后加入1mL生理盐水，室温浸泡15min～30min或4℃冰箱8h以上，取浸泡液12000r/min（离心力10000g）离心5m