可溶性还原糖和总糖的测定.doc

检测技术规范与标准方法 编号：修订：第 1 版 第次修改还原糖和总糖的测定— 35-二硝基水杨酸比色法起草： 日期：201.10.27 批准： 日期：1 目的 建立统一的发酵液中还原糖和总糖的定性检测方法，确保检验方法的一致性、科学性和准确性 2 范围 适用于微生物中心实验室实验、生产发酵液中还原糖和总糖的检验 3 责任者 发酵工艺实验员负责检验 4 正文 4.1 原理 还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。 不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的含量含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。 4.2 仪器和试剂 4.2.1 仪器 分光光度计、电热恒温水浴锅 、试管及试管架 、容量瓶 、移液器 、量筒。 4.2.2 试剂 4.2.2.1 1mg/ml葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。 4.2.2.2 DNS 试剂（3,5-二硝基水杨酸） 将6.3g DNS和262ml 2mol/LNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，7-10天后使用。 4.3 操作步骤 4.3.1 葡萄糖标准曲线制作 取9支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（mL） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 OD540 将以上溶液，封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL，以号管为对照，在50nm下测定吸光值，以葡萄糖质量为Y轴，吸光值为X轴，拟合曲线。 表2 样品还原糖测定 试剂 2 3 样品溶液(m) 0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(m 2.0 1.0 1.0 1.0 DNS（mL） 1.50 1.50 1.50 OD540 通过标准曲线计算得到的还原糖量（mg） 样品中还原糖 4.3.2.3 还原糖和总糖的测定 取4支具塞试管，编号0、1、2、3。以制作标准曲线相同的方法，在1-3号试管分别加入1mL待测液和1mL蒸馏水，1.5mLDNS（保证与葡萄糖标准曲线制作相同的反应体系），而对照的0号管内做则加2mL的蒸馏水和1.5mLDNS。封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL。在540nm下测吸光值。 4.4 结果与计算 计算光密度的平均值，根据所得标准曲线即可得到的还原糖的质量C，按下式计算样品还原糖和总糖的含量。 计算公式由公式：整理得到。 式中，ω1为还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%； ω2为总糖的质量分数，%； C为还原糖或总糖提取液浓度，mg/mL，本公式中C即为根据标准曲线计算得到的还原糖毫克数（测定时取用体积为1mL）； V为提取液的总体积，mL；（提取液的总体积即为稀释倍数） m为样品质量，mg。 4.5 实验注意事项 样品的稀释倍数要保证计算得到的葡萄糖浓度在标准曲线线性关系良好范围内。以往经验和文献报道表明，OD540在0.1-0.4范围内数据较为真实。 发酵饲料中可溶性还原糖测定实验记录 1 葡萄糖标准曲线制作 取9支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（mL） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5