FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一).pdf

FISH 实验标准操作程序 （成都新基因格实验室内部完整版） 一 实验目的 通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断： 提高优生优育（产前诊断中的应用）、 提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、 对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导 用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的 HER-2 基因诊断，针对 CML 患者的 bcr/abl 融 合基因诊断等）。 二 实验原理 利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本 的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况 三 仪器设备及耗材 （一） 仪器设备： ①：全自动分子杂交仪 ②：荧光显微镜及分析软件 ③：恒温水浴箱 3 个以上（小型号） ④：冰箱 2 台（提供试剂和标本存放， 4 摄氏度和-20 摄氏度） ⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心） ⑥：通风橱（配固定液，等操作） ⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。可离 1.5ml 管、0.2ml 管） ⑧：考普林瓶 15 个（FISH 实验中盛放各种试剂，溶液） ⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。 10 ：震荡混匀器 11 ：计时器，温度计，温度湿度显示器。 12 ：载玻片盒（用于存放已经FISH 实验后的 FISH 片子） 13 ：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。 （二） 耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被 乙醇洗掉。） 大盖玻片（方形，用于镜检） 小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片） 离心管（10ml，1.5ml，200ul ） 3ml 一次性吸管 个人防护用品,标签纸等。 四 实验样本及试剂 样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。 试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS 缓冲液、0.08mg/ml 胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶 K工作液、检测试剂盒等。 （二）各种溶液的配制 2.1：制NaOH 溶液 a) 用天平称取4 克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。 b) 用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。 c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。 d) 然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。 2.2：配制 20XSSC溶液： 取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其 完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期 6个月。 2.3：配制 2XSSC溶液： 用 20×SSC 和双蒸水，按 1:9 的比例稀释，调 pH 为 7.0, 封口膜封好，4℃保存备用， 有效期6个月。 2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制 50ml 20×SSC(pH 5.3) 0.5ml NP-40 449.5ml 双蒸水 500ml 调pH 为7.0 ,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。 2.5：系列酒精的配制 取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成 70%和8