第四章-免疫分析技术.ppt

第四章 免疫分析技术 主要内容 第一节 免疫检测技术概述 第二节 四种常见免疫分析技术 第三节 免疫生物传感器 第四节 免疫胶体金标记技术 第五节 免疫亲和色谱 第六节 免疫印迹技术 第一节 免疫检测技术概述 免疫检测技术起源：检测病原微生物抗原及抗体的血清学诊断。 1896年G. Widal和A. Sicard利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效准确地诊断伤寒。 免疫分析法（immunoassay, IA）是利用抗原抗体反应产生免疫复合物的原理分析微量或超微量待测物质的一种分析手段，往往需要借助一种信号放大系统把抗原抗体结合的反应信息予以展现和放大。 免疫分析技术是以抗原与抗体在体外特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。 免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。 免疫分析技术的特点 高度的灵敏性：可检测10-18~10-6级别的物质；（免疫聚合酶链反应，免疫沉淀反应） 高度的特异性：可区别物质间细微的差异，这是其他技术无法比拟的。 免疫分析技术的分类 根据免疫反应的动力学类型分为： 竞争反应：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）共同竞争与抗体的反应。 Ag（样品） + Ab ? AgAb Ag *（定量加入） + Ab ? *AgAb 夹心反应：将抗体、抗原和第二抗体结合在一起，形成夹心式结合物。最终，检测夹心结合物上标记物，计算样品中抗原含量。 Ab1 + Ag + Ab2* ? Ab1-Ag-Ab1* 免疫分析技术的分类 根据抗原和抗体在反应中存在方式不同分为： 均相分析（液相免疫分析）：不需要将游离抗原与结合物分离，直接进行测定。特点：简单省时，适合于测定小分子化合物，灵敏度10-9 g/ml； 异相分析（固相免疫分析）：抗原抗体反应后，将结合物与游离抗原（或抗体）及样品用常规物理方法分离，然后对分离出的结合物进行检测。特点：有较高灵敏度灵敏度10-12 g/ml，干扰少。 免疫分析技术的分类 根据标记方法的不同分为： 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶联免疫分析技术 发光免疫分析技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学、生物发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并借助荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接进行观察或进行自动化测定。 第二节 四种常见免疫分析技术 （1）荧光免疫分析技术 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。 基本原理：荧光免疫分析法是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 （1）荧光免疫分析技术 荧光现象与荧光物质 荧光素(fluorescein): 在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光的一种黄色染料。用于荧光抗体技术中的荧光染料。 常用的荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC），四乙基罗丹明（RB200），四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），酶作用后产生荧光的物质。 （1）荧光免疫分析技术 抗体的荧光素标记 用于标记的抗体要求：高特异性和高亲和力；不应含有针对标本中正常组织的抗体；一般需经纯化提取后再作标记。 作为标记的荧光素要求：具有能与Ab分子形成共价健的化学基团；与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；与Ab结合后不影响Ab的生化与免疫性质；标记方法简单、安全无毒；与蛋白质的结合物稳定，不易解离，易于保存。 （1）荧光免疫分析技术 直接法 优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少， 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体 （1）荧光免疫分析技术 间接法 优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。 应用：常用于微生物检测，例如：沙门氏菌。 （2）放射免疫分析技术 放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 定义：是以放射性核素为标记物的标记免疫分析方法，用于定量测定受检标本中抗原。 1959年，Yalow和Berson创建的分析方法。 基本原理： （2）放射免疫分析技术 常用标记核素： 125I： γ 射线，半衰期 60 天 3H： β 射线，半衰期 12.3 年 测量仪器 γ 计数仪 β 液闪仪 优点： 检测灵敏度高，高达ng~pg水平; 测定的准确性好，数量级的回收