愈伤组织培养生产芍药双苷.docx

通过芍药组织培养生产芍药苷和芍药内酯苷胡升摘要：为了便于对芍药两个主要生物活性成分芍药苷（PF）和芍药内酯苷（AF）制备，对芍药愈伤组织进行了研究。用一种改进的木本植物培养基，添加0.5mg·L?16-苄氨基腺嘌呤，1mg·L?1萘乙酸、0.1mg·L?1 TDZ和30g·L?1蔗糖，愈伤组织从4种外植体诱导：叶，茎，叶柄和根。不同外植体之间形成愈伤组织的效力不同，叶表现出最高的能力（100%）。另一方面，根源性愈伤组织（R-愈伤）产生的PF和AF的总量最高，31.8mg·g?1干物质，这高于在该位置的栽培芍药中根的相应水平。此外，所需的时间只有40天，显著短于芍药约4-5年培养时间。PF和AF较短的生产时间，较高积累水平表明，芍药的愈伤组织培养是在今后生产PF和AF的一个有前途有力工具。关键词：芍药内酯苷；芍药苷；愈伤组织；植物细胞培养；芍药1 前言植物是一个广泛的次生代谢产物的重要来源，如医药，化妆品和有价值的化合物，通过植物的田间栽培获得化学物质需要很长一段时间。尽管合成化学的进展，一个包括药物在内的次级代谢产物仍然从植物中提取。赤芍（RPA），即芍药（Paeonia lactiflora Pall）的根，是中国传统医学中最知名的草药之一。它在治疗类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，肝炎，痛经和发热超过1200多年。赤芍的水/乙醇提取物，被称为白芍总苷（TGP），自1998年以来被国家食品药品监督管理局批准为用来治疗类风湿性关节炎。在TGP中最丰富的活性成分确定为芍药苷（PF）和芍药内酯苷（AF），据报道具有许多生物学特性，包括解热，抗过敏，抗氧化，抗炎和抗焦虑活动。近年来，对PF和AF的需求越来越多。然而，生产PF和AF是缺乏效率的，这就阻止了其广泛的应用。芍药是一种多年生草本植物，通常需要四至五年在根部积累到一个中等水平的PF和AF（低于根干质量的3%）。此外，PF和AF的积累显著取决于栖息地、气候和收获时间，通常是降低PF和AF的水平。不幸的是，类似的问题通常发生在其他植物次生代谢物的生产。解决与传统农业生产的高价值植物次生代谢产物，自从20世纪60年代以来细胞培养技术已被引入作为有前途的替代方法。它提供的优点是在较短的时间内以较低的成本积累较高的产品。许多报告已公布紫草、人参已在植物细胞工业规模生产吲哚生物碱类和紫杉类。但是，到现在为止，没有植物细胞培养生产PF和AF的研究。本研究的目的是从芍药根、茎、叶柄和叶片诱导愈伤组织，通过HPLC和HPLC/ESI–MS证明PF和AF在愈伤组织存在，用于愈伤组织生产PF和AF的评价，并促进愈伤组织积累PF和AF的培养条件优化。一个合适的培养基，愈伤组织培养诱导外植体和在较短的时间内，根衍生的愈伤组织在较短的时间内产生较高量的PF和AF。作为第一项研究从植物细胞培养物制备PF和AF，它证实了这种方法的可行性和优点。2 材料和方法2.1 生物和化学材料安徽亳州四年生芍药为外植体来源。PF和AF（HPLC，N98％）的标准品从Sigma-Aldrich公司购买（圣路易斯，美国）。HPLC级乙腈和甲醇来自ANPEL科学仪器有限公司（上海，中国）。除非另有说明，其他试剂均为分析纯或更高品质（国药集团化学试剂有限公司，中国上海）。2.2 组织培养方法外植体用无菌水彻底洗涤，随后用70％（体积）乙醇洗涤30秒。用无菌水洗涤后，把它们浸泡在10%（体积）的次氯酸钠10分钟（根为20分钟），然后用无菌蒸馏水洗涤五次，每次3分钟。在此之后，将外植体切为适当的大小（茎和叶柄，区隔约8毫米长度；叶片，5毫米×5毫米；根，约1毫米的厚度），并嵌入木本植物培养基（WPM）[含有6-苄氨基嘌呤（6-BA）（2.0 mg·L?1），萘乙酸（NAA）（0.2 mg·L?1），2,4-二氯苯氧乙酸（0.2mg·L?1），蔗糖[3％（按质量）]和琼脂[0.8％（质量）]诱导愈伤组织。温度、pH值和光照强度分别控制在（24±2）℃，5.8±0.1，1500 lx。在32天传代培养，将一些愈伤组织培养物通过转移到新鲜的WPM培养基中添加6-BA（0.5 mg·L?1），NAA（1.0 mg·L?1），TDZ（0.1 mg·L?1），蔗糖（30g·L?1）和琼脂（8g·L?1）。培养条件与愈伤组织培养条件相同。选择生长增殖良好的愈伤组织分析PF和AF的总含量。2.3 流程和数据分析诱导率（%）对愈伤组织诱导进行了评价。诱导率（%）为外植体能形成愈伤组织而不考虑数量和愈伤组织生长状况的百分比，它被定义为（产生愈伤组织培养的外植体∕总数）×100%。愈伤组织增殖的影响，以评估愈伤组织的生长状态。当愈伤组织继代培养，愈伤组织增殖的定义是（收获的愈伤组织质量∕接种愈伤组织质量）×100%。此外，干鲜愈伤组织的质量比（