PCRDGGE操作步骤.doc

16S rDNA - DGGE技术基本路线一 样品总DNA的提取 1 实验器材： 1.5mL离心管，螺口管，锆珠，搅拌器，4℃离心机。 2 实验试剂： PBS（0.05M, pH=7），水饱和酚，TE饱和酚，TNI50，TE缓冲液，TAE缓冲液，NaAc（pH=5.2），氯仿/异戊醇（24：1）（v/v），96%冷乙醇，70%冷乙醇。 3 实验操作： 3.1 细胞的分解 称取食糜0.3-0.5g，入含0.3g锆珠的离心管中，加1mL TN150溶解 然后加入150μL酸性酚，bead-beater 5000rpm，匀浆180秒，冰上冷却 加入150μL氯仿/异戊醇（24/1），vortex几秒，10000rpm离心5min，上清转移至eppendorf管。 3.2 DNA提取 加入150 μL氯仿/异戊醇至eppendorf管 加入150 μL TE饱和酚，涡旋混匀1 min 10000 rpm离心，1 min 重复上述步骤直至界面清晰为止 加入300 μL氯仿/异戊醇，10000 rpm离心1 min 取上清液至另一eppendorf管，加96%冷乙醇1mL 加入50 μL3M NaAc（pH=5.2） -20℃沉淀DNA过夜 10000 rpm离心20 min 去除上清液，加入500 μL 70%冷乙醇溶解沉淀 10000 rpm离心5 min 去除上清液，风干沉淀 加入50μL TE缓冲液溶解DNA -20℃保存提取的DNA 实验注意事项： 酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。 实验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。 实验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4℃下进行。 二 DNA的检测 — 琼脂糖凝胶电泳 试剂和器材：电泳缓冲液（1*TAE），溴乙锭（EB）染色贮存液（1 mg/mL）， 0.25%溴酚兰，琼脂糖，双蒸水。 电泳仪，水平电泳槽，透射紫外灯，胶带纸。实验操作 2.1 凝胶板的制备： 称取1.2 g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入100 mL 1*TAE稀释缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解（透明溶化液）。戴手套操作：小心加入5 μL EB染色贮存液，摇匀。 用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好，形成一个胶模，水平放在工作台的位置上。将梳子插进托盘长边的凹槽内，梳出底边和托盘表面保持0.5-1mm的间隙。 待琼脂糖冷却至65 ℃左右，将温热凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 待凝固完全后，用小滴管在梳出附近加入少量TAE缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拨出样品槽摸板，则在胶板上形成互相隔开的样品槽。 取下封边的胶带纸，将凝胶连同托盘（凝胶板点样孔靠近负极一端）放入电泳槽平台上，倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3 mm。 2.2 加样： 用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA加入加样孔内。 2.3 电泳： 加样完毕，盖上电泳槽，通电5-10 v/cm，恒压电泳，DNA向阳极移动，当染料条带移动到距凝胶前沿约1cm处时，停止电泳。 2.4 观察： 小心取出凝胶置托盘上，推至预先用75%酒精消毒的紫外灯观测台上，在波长250nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现桔红色荧光。肉眼可观测到清晰条带，荧光在4-6h后减弱。 实验注意事项： 溴化乙锭（EB）是诱变剂，配置和使用时应带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上，凡是被其沾污的地方须经专门处理后才可进行清洗和消毒。 加样多少取决于加样槽大小，加入样品体积应略小于加样槽体积。 观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。 正确选择电泳缓冲液，因为缓冲液中缺失离子，DNA全然不动或迁移很慢，高离子强度 则在电泳中会产生大量热量，凝胶融化导致DNA发生变性。本实验选择1*TAE缓冲液。三 16s rDNA片段扩增 1 细菌通用引物： EUB-968Gc for：5ˊ CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA GGG GAA CGC GAA GAA CCTTAC 3ˊ EUB-L1401 rev：5ˊ CGG TGT GTA CAA GAC CC 3ˊ 2 反应体系： 反应液组成： 单个样品量 MQ 37.75 μL dNTP 0.5 μL MgCl2 3 μL PCR缓冲液