实验三细胞减数分裂染色体制片技术.doc

实验三 细胞减数分裂制片与减数分裂过程的观察 [实验目的] 1．学习和掌握细胞减数分裂染色体标本的制片技术和方法。 2．通过观察进一步熟悉减数分裂的全过程及各个时期染色体的动态变化和形态特征。 [实验原理] 减数分裂是发生在配子形成过程中一种特殊形式的有丝分裂，分裂过程中染色体结构也呈周期性变化，并在特定时期呈现稳定的形态特征，因而也是进行染色体形态、结构与数目鉴定的有利时期。减数分裂包含两次连续的有丝分裂——减数第一分裂和减数第二分裂；每次分裂都可分为紧密衔接的前、中、后、末四个时期，以前期Ⅰ变化最为复杂，又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。通过减数分裂所形成的四分体细胞（或雌、雄配子），其染色体数目只有体细胞的一半。减数分裂过程中染色体出现同源配对、非姊妹染色单体间片段交换、同源染色体相互分离等一系列独特行为，为远缘杂种的分析及三大遗传定律的论证等遗传研究提供了直接或间接的证据。 减数分裂细胞染色体制片取材以高等动、植物雄性生殖分裂较为方便。在适当的时机采集动物精巢或植物花蕾(花序)，经适当技术处理，压片就可在显微镜下观察到细胞的减数分裂过程。 [实验材料] 1．水稻蝗虫（Oxya intricata stal） 其染色体数为：雌虫（2n=2x=24,XX）；雄虫（2n=2x=23,XO）。雌虫比雄虫个体长，腹部末端为产卵器，呈分叉状。雄虫腹部末端为交配器，形似船尾。 2．性成熟的雄性小白鼠（Mus musculus，2n=2x=40）。 3．植物类材料 黑麦(Secale cereale, 2n=2x=14)、大麦(Hordeum sativum, 2n=2x=14)、玉米(Zea mays, 2n=2x=20)、普通小麦(Triticum aestivum, 2n=6x=42)、大葱(Allium fistolosum, 2n=2x=16)的幼嫩(雄)花序；蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)、豌豆(Pisum sativum, 2n=2x=14)、 萝卜（Raphanus sativus,2n=2x=18），韭菜（Allium tuberosum, 2n=2x=32），柚（Citrus grandis,2n=2x=18,36），梨(Pyrus communic,2n=2x=34)，苹果（Pyrus malus,2n=2x=34），茶（Camellia sinensis,2n=2x=30）等的幼嫩花蕾(或其固定材料)等； [实验器具、药品] 显微镜，计时器；染缸，染色板，酒精灯，白绸，镜头纸，培养皿，材料瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖刀，解剖针，镊子，刀片，木夹，吸水纸，标签，铅笔等常用工具。 卡诺氏Ⅰ，甲醇冰乙酸（甲醇∶冰乙酸=3∶1）固定液，FAA固定液；甘油蛋白，１mol/L HCI， 45％乙酸；0.5％醋酸洋红或醋酸地衣红，改良苯酚品红，醋酸-铁矾-苏木精，丙酸-水合氯醛-铁矾-苏木精，丙酸-水合氯醛-铁矾-洋红等染液；无水乙醇，95％乙醇，80％乙醇，70％乙醇；石蜡。 [实验方法] 一、蝗虫精巢染色体制片与观察 1．材料采集与预处理 于八至九月采集雄蝗虫，立即投入甲醇冰乙酸固定液中固定24h（或取♂虫精巢，用甲醇冰乙酸液固定30～60min）。若暂时不用，可用95％乙醇清洗2次， 70％乙醇于4℃冰箱中保存（在70％乙醇与等量甘油的混合液中可长期保存）备用。 2．取精巢 取固定好的雄蝗虫，剪去翅膀，沿背侧背中线剪开体壁，用镊子于第2～3背板下取出精巢（褐色，左右各一），于白瓷板窝内水洗干净，吸去多余的水分。 3．酸解 用镊子纵向夹注输精管，将精细管横切成两段，取较粗（游离）的半段（细胞分裂旺盛）在白瓷板另一窝内，用１mol/L HCl酸解3～5min。 4．染色 将改良苯酚品红（或其它染液）滴加在一染色板窝内，把酸解好的材料放入其中，染色15～20min； 5．压片 挑取2～3条已染色的精细管放于载玻片上，滴一滴染液，盖上盖片，在盖片上覆一张吸水纸，吸去多余的染液，换一张干净的吸水纸，一手固定盖片和载片，另一手用铅笔的橡皮头垂直敲打，使细胞分散、压平。 6．镜检 在低倍镜下寻找适当视野，换高倍镜仔细观察和区分处于减数分裂各个时期染色体的形态特征。 二、小鼠精巢染色体制片与观察 1．秋水仙素处理 取睾丸前3～4h给小鼠经腹腔注射秋水仙素（100ug/ml）0.2～0.4ml。 2．取精巢固定 用脊髓损伤法处死小鼠，放在解剖板上固定四肢，剖开腹腔取出睾丸，用2％的柠檬酸钠溶液洗净，投入甲醇冰醋酸液固定12h（或取精细管固定30～60min），若暂时不用，可用95％乙醇清洗2次， 70％乙醇于4℃冰箱中保存（在70％乙醇与等量甘油的混合液中可长期保存）备用。 3