细胞生物学研究技术-流式细胞术.ppt

PCR技术 流式细胞术 单克隆抗体技术 流式细胞术 一、流式细胞术的定义 流式细胞术是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 二、流式细胞术的原理 细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色，然后使悬液中的细胞以每秒2万~5万个的速度一个个地通过流式细胞仪。当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷或不被充电，同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测细胞的含量。因带有不同表面标记的细胞所带的电荷不同，当液滴通过高压偏转板时，带不同电荷的液滴发生偏转，从而达到将细胞分选的目的。 流式细胞仪 三、流式细胞仪的组成 1、激光光源 2、流室 3、讯号检测器 4、讯号分析部件 液滴形成振荡器 细胞悬浮液和鞘液 荧光探测器 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞悬液 标记荧光抗体 检测 细胞分选 四、流式细胞术操作流程 继续培养 五、流式细胞术的应用 流式细胞术现在已应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。 例如白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和爱滋病感染者T4、T8细胞的记数。 单克隆抗体技术 一、单克隆抗体技术的原理 B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无丝分裂；而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两亲本细胞的特性，而能产生抗体又能无限增殖。 把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性,一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体,另一方量面像肿瘤细胞一样,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,从而分泌大量单克隆抗体通过HAT选择培养和细胞克隆可以获得能大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 二、单克隆抗体技术的过程 单克隆抗体技术的过程图 单克隆抗体技术 免疫小鼠 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 PCR技术 一、ＰＣＲ技术的基本原理 　 首先使双链ＤＮＡ在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链ＤＮＡ配对结合，再在中温下利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合（延伸）反应。 每经过一次变性、退火、延伸３个步骤为一个循环，通过３个不同温度的重复循环，在经过约３０次后，所扩增的特定序列的数量可增至１０9倍。 PCR技术 用另一种方式表示PCR循环 PCR技术 二、ＰＣＲ技术的实验体系 Pcr仪 举例： PCR技术 PCR技术及应用 三、PCR技术的应用 PCR技术应用非常广泛在生命学科学、医学工程 遗传工程、疾病诊断、法医学 、考古学等都有应用。其中在基因克隆 基因检测 基因配型 基因鉴定上应用比较成熟。 四、补充：视频 基因工