嗜麦芽寡养单胞菌DR-929纤溶酶的发酵条件优化及其分离纯化.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（９）：４７～５２ 嗜麦芽寡养单胞菌（ＤＲ９２９）纤溶酶的发酵 条件优化及其分离纯化  王高学 　梁朝军　黄海洪　王建福　原居林 （西北农林科技大学动物科技学院　杨凌　７１２１００） 摘要　研究了嗜麦芽寡养单胞菌（ＤＲ９２９）纤溶酶的液体发酵条件及其分离纯化。最佳发酵条件 为：可溶性淀粉２．０％，黄豆粉１．０％，酵母膏０．５％，ＮａＣｌ１．０％，ＣａＣｌ０．０２％，ＭｇＳＯ０．０５％，种 ２ ４ 龄３６ｈ，发酵时间４ｄ，初始ｐＨ８．０或９．０，温度２５℃，装样量３０ｍｌ，接种量５％或６％。采用发酵液 离心除菌，２５％～７０％饱和度的硫酸铵沉淀，ＰｈｅｎｙｌＦＦ（ｈｉｇｈｓｕｂ）疏水层析，ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子 交换层析，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５凝胶过滤层析对活性成分分离纯化。用ＳＤＳＰＡＧＥ电泳对纯化效果进行 检验，结果表明在ＳＤＳＰＡＧＥ中得到单一条带，分子量２８．３ｋＤａ。最终纯化倍数和酶活回收率分 别为２７１．５和２４．５％。 关键词　嗜麦芽寡养单胞菌　纤溶酶　发酵条件　分离纯化 中图分类号　Ｑ８１４ 　　血栓栓塞是导致心肌梗塞、脑血管血栓形成、脑血 １　材料与方法 栓、肺栓塞等疾病死亡率最高的主要原因之一。溶解 血栓是治疗这类疾病的首选方法。但当前的溶栓剂， １．１　材　料 如尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等，存 １．１．１　菌种　嗜麦芽寡养单胞菌（ＤＲ９２９），本实验室 ［１］ 在半衰期短、副作用大、价格昂贵等各类缺点 ，为了 分离获得。 研究开发出更多高效、低毒和价廉的溶栓药物，近年 １．１．２　试剂与仪器　纤维蛋白原、凝血酶均为Ｓｉｇｍａ 来，对溶栓药物来源的研究越来越广泛，在极端微生物 公司产品；尿激酶为中国药品生物制品检定所产品；３ ［２］ （如ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｉｅｓ） 、植物根部（如 １８Ｋ高速冷冻离心机（Ｓｉｇｍａ公司）；ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ１００ ［３］ Ｓｔｅｍｏｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍｉｑ） 、藻 类 （如 Ｃｏｄｉｕｍ （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ公司）；Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ电泳系统 ［４］ ［５］ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ） 、蚯蚓（如Ｅｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ） 等均有报道。 （美国ＢｉｏＲａｄ公司）。其它试剂均为分析纯。 本实验室从青海省玉树藏族自治州海拔３３００ｍ的泥土 １．１．３　培养基　种子培养基与基础培养基均为ＬＢ液 中筛选出一株溶血栓细菌（ＤＲ９２９），经生理生化和 体培养基。 １６ＳｒＲＮＡ序列分析鉴定 为 嗜麦芽寡养单胞 菌 １．２　方　法 ［６］ （Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ） 。本文主要研究了该 １．２．１　发酵条件优化　在基础培养基的基础上优化 细菌产纤溶酶的发酵条件优化以及从发酵液中分离纯 嗜麦芽寡养单胞菌（ＤＲ９２９）产纤溶酶的液体发酵条件 化纤溶酶，以期为进一步研究提供基础资料。 （培养基组成和培养条件）。 　　种子液的制备：菌种活化后接入种子培养基中， ２５℃，１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ。