国家自然科学基金申请书 模板.doc

一、立项依据与研究内容 （一）项目的立项依据 DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统广泛存在于生物体中，它是细胞复制后的一种修复机制 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [1-3]。其功能是在含有错配碱基的DNA分子中切除配对错误的片段，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶等的作用，重新合成配对正确的片段，使DNA恢复正常的核苷酸序列。因此，它起着增强DNA复制保真度、修复DNA错配、降低基因变异和维持基因组稳定性的作用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [4-5]。近来，MMR系统的研究越来越受重视，对MMR作用机制及该系统的组成结构与功能分析方面的研究正不断深入 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [6-8]。由于在越来越多的肿瘤(如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺肿瘤等)细胞中找到DNA MMR基因突变或缺陷的痕迹 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [9-11]。MMR系统与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研究热点，MMR基因也成为继癌基因与抑癌基因之后被确认的第三类肿瘤相关基因 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [4]。 外源性的持续刺激是细胞复制出现DNA错配的重要原因之一，而日益严重的化学污染又使生物受到的外源毒素刺激与日俱增，生物细胞内DNA损伤与错配几率因而也急剧增加 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [12-15]。错配的DNA序列如果不能得到修复，将导致突变频率增加，基因突变事件放大，最终会引起肿瘤等相关疾病的发生发展。事实上，人类MMR系统不仅能识别多种需要进行核苷酸切除与重新合成的DNA错配，还能参与如O6-甲基鸟嘌呤和UV诱导的光产物等造成的DNA损伤的修复 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [16-19]。这说明MMR系统极可能参与了暴毒后DNA损伤的修复。另有研究显示，毒物暴露不但会使DNA错配概率显著提高而增加MMR系统的负荷，而且有些致癌物可能会直接损害MMR基因，使MMR活性降低甚至丧失。其中，Feitsma等通过使用强致癌物乙基亚硝基脲来诱变获得MSH2、MLH1、MSH6和PMS2等MMR基因缺陷型斑马鱼就是一个重要的例证 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [20-26]。因此，日益严重的环境污染对生物及人类构成的健康风险之一可能就是阻断或干扰细胞的DNA MMR活性。然而，目前将DNA MMR活性分析与环境毒理学相结合的研究在国际上仍为空白，这与当前DNA MMR活性分析方法较为繁琐及环境毒理研究对所需的异源核酸分子的质与量要求很高有关。 除了本课题拟开展的活细胞DNA MMR活性分析技术以外，生物体MMR功能的主要分析方法还有两种。第一种是以噬菌体M13mp2及其衍生株为材料 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [27-30]，该法利用噬菌体M13mp2及其一种衍生株作为材料，各自提供一条正链ssDNA和一条负链ssDNA，这两条ssDNA退火杂交后可形成一个带预设错配位点的环状异源dsDNA。将这种含错配碱基的异源dsDNA转入自身错配修复功能缺失的宿主菌E.coli(NR9160)，在培养平板上就会出现混合噬斑。若将这种异源dsDNA与样本细胞提取物在体外作用后再次转化NR9162，样本细胞的MMR系统对错配位点的修复情况可通过指示板上的混合噬斑比率的变化来指示，进而分析样本的DNA MMR活性。第二种以寡聚核苷酸为材料[31]，该法采用人工合成的寡聚核苷酸来制备含有错配碱基的异源dsDNA，在错配碱基处预设特异性限制性内酶切位点．如果待测样本的MMR功能完整，其提取物在体外与这种异源dsDNA作用后，在错配碱基得到修后异源dsDNA即变为同源dsDNA,预设的酶切位点也就同步恢复。通过电泳检测修复后的dsDNA的限制性酶切产物的有无和多少来对样本MMR功能做定性或初步的定量分析。 这两种方法自建立后，在一定程度上促进了对DNA MMR功能活性研究的发展，但也都存较大的局限性。首先，这三种方法均为体外法，不能准确反应生物体内的真实状况。其次，分析过程复杂，需要多个步骤，而且指标参数的灵敏度和准确度都较低。由于这些方法仅限于特定生物体MMR活性的体外分析，很难在实际研究中广泛推广，这在一定程度上导致了国内在该研究领域力量比较薄弱的局面。但是，复旦大学的王怡等 ADDIN EN.CITE EndNoteCiteAuthorLei/