生物工程下游技术应用第十五章目标产品蛋白质分析检测工作和质量控制.ppt

第十五章 目标产品的蛋白质分析检测技术及质量控制 基因工程产品的鉴定 美国食品与药品管理局的要求： 分子量,溶解度,等电点,氨基酸序列,肽谱,二硫键配对,糖脂电泳图谱,二级结构,三级结构,与内源性物质的关系,受体的分布和结合等。 一、蛋白质含量和纯度 含量:mg/ml, mg/g材料 纯度:每单位重量样品中目标蛋白质占总蛋白的比例.是一个相对指标,可用百分比表示.一般指是否含有杂蛋白,而不包括是否含有盐、离子等小分子的物质。纯度等级可分为95%，99%和99.9%等。 蛋白质含量和纯度测定方法 含量测定:凯氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚法、紫外线法和考马斯亮兰法（Bradford法）。 纯度衡量:电泳法、层析法、质谱法等。 一般应采用二种以上方法鉴定纯度，而且同一原理的方法不应该采用二次。 五种蛋白质测定方法比较 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法 灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100?g 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法 灵敏度高 ～5?g 慢速 40～60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法 灵敏度最高 1～5?g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其?max由465nm变为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 氨基酸分析 柱后反应法：将游离氨基酸经过色谱柱分离后，氨基酸再与显示剂（茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛）作用。 柱前衍生法：将各种氨基酸和荧光试剂先生成氨基酸衍生物，然后再用柱把各种衍生物分开。 蛋白质的分子量测定 超离心法 光散射方法 凝胶过滤法（测完整蛋白质分子） SDS电泳法（测亚基） 较新的方法：毛细管电泳、质谱 等电聚焦法 测定蛋白质的等电点 鉴定蛋白质的纯度 肽谱 指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。 蛋白质突变点分析 天然蛋白质和突变蛋白质肽谱的比较 荧光标记Cys; 同位素标记法； 紫外吸收法 二硫键分析 同位素标记 化学修饰 直接分析二硫键的异构物 质谱定位二硫键 蛋白质的序列测定 测定蛋白质的一级结构方法： 蛋白质化学法：（Edman降解法测定N端和羧肽酶或化学法测定C端） cDNA演译法 质谱法 二维核磁共振 试分析影响蛋白质在电场中行为的主要因素? 什么叫蛋白纯度?如何测量蛋白质纯度? 选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 * 蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 * * 选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 * 蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 * *