TRIM33通过SIRT1依赖的去乙酰化修饰调控MCM7在肺癌中的功能及其机制研究.pdf

摘要

摘要

研究背景：

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球死亡率最高的癌症，而其中非小细

胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型。虽然在过去的几十年肺癌的临床治疗取得

了很大的进展，但目前肺癌的5年总生存率（OS）仅18%~19%，而NSCLC的

OS约为15%。肺癌患者的OS相对较低可能归因于缺乏高度敏感的早期筛查诊

断和精确的靶向治疗。因此，寻找新的分子靶点，对于提高肺癌患者生存率、改

善预后具有重要的意义。

TRIM33（TripartiteMotifContaining33）是三结构域蛋白（TRIM）家族中的

一员，由于该家族成员普遍具有RING结构域，被视为一类典型的E3泛素连接

酶，广泛参与了免疫、炎症、肿瘤等生理病理过程。其中，TRIM33在肿瘤中的

功能较为复杂，其在不同肿瘤中可能发挥的作用不同。目前对于TRIM33在肺癌

中的功能及其机制并不明确，特别是TRIM33是否通过其E3泛素连接酶的功能

影响NSCLC的发生发展亦不可知。

目的：

通过细胞表型实验分析TRIM33在非小细胞肺癌中的功能，后发现TRIM33

可抑制NSCLC细胞增殖，但其具体作用机制不明确。本文将探讨TRIM33通过

微小染色体维持蛋白7（Minichromosomemaintenanceprotein7，MCM7）调控细

胞增殖的潜在机制，并将进一步分析该调控机制与TRIM33的乙酰化修饰之间

的可能联系。

方法：

（1）通过蛋白免疫印迹实验(WesternBlot)检测TRIM33在正常肺上皮细胞和

NSCLC细胞株中的表达情况。利用TCGA和GTEx数据库分析TRIM33在正常

肺组织和NSCLC组织中的差异表达情况，以及TRIM33与疾病分期和患者生存

期的关联。

（2）构建TRIM33过表达和敲除质粒，用细胞生长实验和transwell实验评估

NSCLC细胞株NCI-H1299在TRIM33过表达或敲除条件下的细胞增殖和迁移情

II

摘要

况。用WesternBlot检测N-cadherin、β-catenin、Vimentin和Snail的蛋白水平考

察细胞的EMT情况。

（3）利用质谱分析法(MS)、免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光技术(IF)确定

TRIM33和MCM7的相互作用，用WesternBlot检测过表达或者沉默TRIM33对

MCM7蛋白水平的影响。接着通过Co-IP检测过表达TRIM33后MCM7的泛素

化水平变化。

（4）用广谱去乙酰化酶抑制剂TSA和NAM处理细胞，检测TRIM33的乙酰

化、mRNA和蛋白表达水平变化。

（5）检测外源表达去乙酰化酶SIRT1、SIRT6和SIRT7后TRIM33的蛋白水

平变化。再通过Co-IP验证SIRT1和SIRT6与TRIM33的蛋白相互作用，及二

者对TRIM33乙酰化水平的影响，以确定TRIM33的特异性去乙酰化酶。最后用

Co-IP检测SIRT1是否参与TRIM33调节MCM7泛素化的过程。

结果：

（1）与正常的肺上皮细胞相比，NSCLC细胞系中TRIM33的表达显著下调。

数据库分析结果显示，与邻近的癌旁组织相比，TRIM33在NSCLC组织中的表

达下调，且TRIM33低表达的NSCLC患者生存率较差。此外，TRIM33与疾病

分期无显著相关性。

（2）过表达TRIM33抑制了NSCLC细胞的生长、迁移和EMT相关蛋白表达，

而敲除TRIM33则促进了细胞的生长、迁移和EMT相关蛋白表达。

（3）质谱与免疫荧光染色显示TRIM33可能与MCM7存在蛋白互作及细胞共

定位，免疫共沉淀进一步证明TRIM33与MCM7相互作用并增加其泛素化水平，

但是TRIM33不影响MCM7的蛋白稳定性。