sirna的发展历史原理应用的进展和发展趋势.pptx

siRNA制备方法;A. 化学合成法;选择以AA开头的19-21nt长的序列 靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束 选择 2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验 选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。 若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好. 最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性 设定适当的对照 ;设置适当的siRNA对照;siRNA序列设计;B、体外转录合成短的siRNA; C、 使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA;１、含有T７启动子的PCR产物的合成;D1、质粒载体合成siRNA（非病毒）;D2、病毒载体合成siRNA;E、PCR方法构建siRNA表达元件（SEC);常用的发卡结构中Loop环的长度和序列;? ;　ＲＮＡ干扰的应用（Application）;RNAi 技术的应用: 基因治疗 ; RNA干扰最初的研究多局限于植物、线虫和果蝇等的研究.对哺乳动物的研究则是在最近几年,对其发生机制有了初步了解后才开始的. RNA干扰技术在实验动物体内的研究目前在国内还鲜有报道,在国外也不多见.目前的研究多局限于细胞水平.如何将siRNA安全有效地导入动物体内,即载体的选择,是制约RNA干扰技术在实验动物体内应用的瓶颈之一.但RNAi诱人的应用前景仍吸引着许多科学家, 研究小组,实验室以及国际知名的生物公司投入到这放方面的研究.; 如Brummelkamp 等建立了突变体K-ras V12 的siRNA 表达系统pSUPER-K-ras V12 ,通过转染人胰腺癌CAPAN-1 细胞系,观察其抑制内源K-ras V12 的表达,结果显示pSUPER-K-ras V12能显著降低K-ras V12的mRNA 表达水平,而对照组cyclin D1 的表达水平没有影响;构建突变体K-ras V12 的siRNA病毒载体转染CAPAN-1 细胞能明显抑制细胞克隆的生长,以及阻止裸鼠肿瘤的形成,而对照组细胞生长良好并产生克隆,体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤,因此证明了siRNA 具有明显的特异性和抑制肿瘤生长作用,为肿瘤研究提供了新的技术方案[21] 。 ; Wilda 等[22 ] 设计了M-BCR-ABL 融合蛋白的dsRNA ,通过转染白血病细胞株K562 细胞,研究对白血病细胞的杀灭作用。结果表明siRNA 能明显降低bcr-abl 的mRNA 表达水平,减少bcr-abl 癌基因的表达,导致白血病细胞的凋亡.; Cioca 等[ 23 ] 报道采用siRNA 转染人髓白血病细胞系HL-60 ,U937 ,THP21 ,K562 ,观察其对内源性c-raf和bcl-2 基因的抑制作用以及对肿瘤细胞分化、凋亡和对药物足叶乙甙(etoposide) 和柔红霉素( daunorubicin) 敏感性的影响。结果表明,siRNA 能减少raf-1 和bcl-2 蛋白的表达; c-raf 的siRNA 能阻止佛波醇酯( TPA) 诱导的单核细胞分化; c-raf 和bcl-2 的siRNA能诱导人髓细胞性白血病细胞HL-60,U937,THP-1凋亡;siRNA 联合抗癌药物足叶乙甙和柔红霉素能明显提高药物的作用效果。因此作者认为RNAi 可用于人髓细胞性白血病的研究和治疗,并克服癌细胞对抗癌药物产生的抗性,最终提高人髓性白血病的化疗效果。; 尽管RNAi 应用于肿瘤的研究才刚刚起步,但科学家已经认识到其在肿瘤研究中的巨大潜力。应用RNAi 技术抑制肿瘤细胞中过量表达的一些凋亡抑制剂如bcl-2 、c-myc 等,将有利于癌症的治疗。因此可以认为RNAi 是继PCR 后又一划时代的基因工程方法,是肿瘤治疗的新希望。它的发现为后基因组时代系统的研究基因的功能提供了一个高效的研究方法,同时为我们在治疗某些难治性疾病如肿瘤、病毒性疾病等方面提供了丰富的想象空间;一点声明