《Kozak序列（＋4G）对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响》.pdf

生 物 技 术 通 讯 LEqTERSIN BIOTECHN0L0GY Vo1．22No．2Mar．，2011 149 doi：10．3969~．issn．1009—0002．2011．02．001 研究报告 Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白 751在 CHO细胞中表达的影响 黄巍 ，庞蓓蓓 ，熊波 ，周婷 ，刘桥 1．武汉市医学科学研究所 基础 医学研究室，湖北 武汉 430014 2．武汉市疾病预防控制中心 病毒科，湖北 武汉 430015 [摘要] 目的：观察 Kozak序列 (+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋 白(hAPP751)一EGFP融合真核表达载体在 CHO 细胞 中表达 的影响，为 APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法 ：分别将含 Kozak序列(+4G)和不含 Kozak序列的 hAPP751全长基 因片段亚克隆入 pEGFP—N1表达载体 ，得到 pEGFP—hAPfy751(+4G)和pEGFP—hAPP751重组质粒 ， 转染 CHO细胞 ，通过 G418筛选稳定转染细胞株 ，再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆，并观察 融合蛋 白的表达强度和细胞定位 ，最后用 EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋 白。结果：PCR、酶切和测序证明 将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入 了真核表达载体 pEGFP—N1中；荧光 显微镜下观察pEGFP—hAPP751(+4G)稳定转染细胞 的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光，其 中在细胞质 中成不 均匀颗粒状分布 ，Western 印迹检测到相对分子质量约 156000的融合表达蛋 白，与预期相符；pEGFP—hAPP751转 染细胞，其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布，Western 印迹检测到相对分子质量约26000的EGFP，但检测 不到预期的hAPP751一EGFP融合表达蛋 白。结论 ：Kozak序列 (+4G)可以明显促进 hAPP751的表达 ，获得稳定转染且 高水平融合表达 hAPP751一EGFP的细胞株。 [关键词] Kozak序列 (+4G)；人淀粉样前体蛋 白751；增强型绿色荧光蛋 白；阿尔茨海默病 ；真核表达 [中图分类号] Q78；R749．16 [文献标识码] A [文章编号] 1009—0002(2叭1)02—0149—05 EffectofKozak Sequnce +4G on theExpression ofHuman Amyloid PrecursorProtein 751Fused with EGFP in CHO Cells HUANGWei，PANGBei—Bei2,XIONGBo，ZHOU死n ，LIUQio． 1．DeparmentofPreclinicalMedicine，Wuhan InstituteofMedicalSciences，Wuhan 430014； 2．DepartmentofVirus，Wuhan CenterforDiseaseControland Prevention，Wuhan 430015；China [Abstract] Objective：ToinvestigatetheeffectofKozaksequence+4Gonexpressionofhumanamyloidprecur— sorprotein751(hAPP751)andenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)fusiongene．Methods：Twodifferentfull length hAPP751gene fragments，onehad Kozak sequence+4G，while theotherhad no Kozak sequence，were ob— tained through PCR withdifferentprimers，andwere inserted intoEGFP expression vector，pEGFP-N1．Therec