噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏噬菌体效价的测定细菌转导测定凝聚反应沉淀反应..docx

微生物学实验实验名称 噬菌体裂解液的制备和菌种保藏噬菌体效价的测定、细菌转导的测定凝聚反应、沉淀反应姓名学号系别班级实验日期同组姓名[实验原理及摘要]1、噬菌体效价的测定溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指1mL噬菌体裂解液中所含噬菌体的数量在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位（plague-for ming units, pfu）进行噬菌体效价的测定，一般用双层琼脂平板法测定。2、细菌转导的测定转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性细菌E. coli K12 F(λ)gal-为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型的噬菌体（λ和λdg）。λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)，当缺陷型噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得基因gal，从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。3、凝聚反应凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的凝集块。电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表面的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在37℃或56℃水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为++）的最高稀释度的倒数值为该免疫血清的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快速，是鉴定传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴定相应抗体的效价。4、沉淀反应沉淀反应与凝集反应的基本原理相同。不同的是沉淀反应所采用的抗原是可溶性的，如血清、细菌渗出物等。由于抗原是可溶的，抗原与抗体反应的结果时形成很细微的沉淀。沉淀反应可以在液体中进行，也可以在凝胶中进行。以液体形式在试管中进行时，抗原与抗体在交界面处形成环状的乳白色沉淀物，故称环状沉淀反应。双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。[实验目的]1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。3、了解菌种保藏的基本原理和方法。4、学习微生物大小的测量。5、学习噬菌体效价测定的方法6、了解转导原理、学习转导实验方法7、学习凝集反应和沉淀反应的实验方法8、了解血清学反应在实际中的应用9、了解凝集反应的基本原理[实验材料]菌种：大肠杆菌E.coli K12 F gal+（双重溶源菌，含有λ噬菌体和缺陷型噬菌体λdg的基因组，发酵半乳糖）；大肠杆菌E. coli K12 S gal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖）培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基、加倍肉汤培养基、半固体素琼脂、磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、无菌水、氯仿、EMB培养基仪器及用具：试管、三角瓶、离心机、离心管、振荡器、培养皿、紫外灯（UV灯，30W）、磁力搅拌器、涂布器、酒精灯、恒温水浴箱、培养箱等 其他材料：E. coli及其抗血清人IgG及兔抗人Ig G载玻片、1%琼脂糖、打孔器等[实验内容及步骤]一、噬菌体裂解液的制备和菌种保藏1、菌种活化37℃18～24 hr37℃4～6 hr3000 rpm10 min离 心K12F牛液牛 液弃上清，用等体积PB（2mL）悬浮细胞，制成菌悬液2、UV诱导及增殖培养UV 1min 2mL菌悬液磁力搅拌UV 13 Sec （开盖）避光培养37℃, 2 hr2mL加倍肉汤离心管加0.2mL 氯仿，震荡30S，静置5分钟；离心（3000rpm, 10min），收集上清（噬菌体裂解液）。3、菌种保藏原则：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。二、噬菌体效价的测定、细菌转导的测定1、噬菌体效价的测定1）受体菌（E. coli k12 S gal-）活化2）噬菌体裂解液的制备取0.5mL前述制备的噬菌体裂解液，用每管4.5mL牛液将噬菌体裂解液稀释到10-43）倒平板牛肉膏蛋白胨培养基：5个平版EMB培养基：5个平板 4）将素琼脂溶化，保温于50℃，向每支素琼脂中接入0.5mL K12 S gal-，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5mL（、），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。5）培养 待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h； 根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。（因所测噬菌体裂