农用基质中芸薹根肿病菌检测技术规程.docx

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DB××××-××××

农用基质中芸薹根肿病菌检测技术规程

1范围

本文件规定了上海地区农用基质中芸薹根肿病菌检测技术方法及流程。本文件适用于上海地区农用基质中携带芸薹根肿病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2118蔬菜育苗基质。

NY525有机肥料

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文本。3.1

基质（substrate）

基质的定义参照NY/T2118，能够代替土壤，为栽培作物提供适宜养分和pH，具备良好的保水、保肥、通气性能和根系固着力的混合轻质材料，组分包括草炭、蛭石、珍珠岩、木屑、作物秸秆、畜禽粪便、树皮和菌渣等。

3.2

根肿病(clubroot)

由芸苔根肿菌引致的十字花科（Cruciferae）植物病害，植株受害后在根部形成大小不一、光滑或龟裂粗糙的肿瘤，而植株的地上部份生长迟缓、缺水蔫萎，严重时植株死亡。根肿病可以通过带菌基质、土壤、种苗、水流、农事操作等方式传播，病菌在土中可存活10年以上。芸薹根肿菌为专性寄生菌，不能人工培养，病菌的检测主要是采用PCR的分子检测。

4原理

4.1分类地位

芸薹根肿菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin），芸薹根肿菌属于原生动物界（Protozoa），根肿菌门（Cercozoa），植物寄生黏菌纲（Phytomyxea），根肿菌属（Plasmodiophora）。

4.2巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部），结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短

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于第一次扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少），增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。因遇到农用基质中携带根肿病菌含量比较低的情况，故本规程规定采用巢式PCR扩增的检测方法。

5仪器和试剂

5.1主要仪器

5.1.1恒温鼓风干燥箱：满足168℃消毒2小时的功能。

5.1.2高压湿热灭菌锅：满足121℃饱和压力蒸汽消毒15min~30min的功能。

5.1.3研钵：陶瓷材质，口径60mm~100mm之间。

5.1.4水浴锅或干浴锅：50℃-80℃恒温功能。

5.1.5高速冷冻离心机：离心转速10000g以上。

5.1.6PCR仪：常规PCR扩增功能。

5.1.7旋涡振荡器：具有点振和连续振荡功能。适配1.5mL、2.0mL等规格离心管。

5.1.8凝胶成像仪：常规的PCR扩增产物电泳拍照与记录功能。

5.1.9微量移液器：规格0.1μL~2.5μL，2μL~20μL，20μL~200μL，100μL~1000μL。

5.1.10电子天平：精度0.001g以上。

5.2主要试剂

5.2.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中二级水规格以上的双蒸水或超纯水。

5.2.2DNA提取试剂盒：选择质量稳定的商用产品，试剂盒提取总DNA质量要达到或优于附录B1图示提取总DNA质量。

5.2.3PCR扩增相关试剂，无水乙醇等常规试剂。

6检测与鉴定

6.1采样

样品抽样和缩分方法按照NY525规定执行。抽取样品于-20℃或-80℃（更佳）保存备用。

6.2样品制备

每个样品取2份实施平行检测。样品研磨和总DNA提取见附录B.1。

6.3巢式PCR检测

采用巢式PCR方法进行病菌检测，具体操作见附录B.2。

7结果判定

7.1外圈引物对的PCR扩增结果待检测样品为阳性，判定样品检出芸薹根肿病菌。

7.2外圈引物对的PCR扩增结果待检测样品为阴性，第一轮PCR检测结果无法判断，应实施巢式PCR内圈引物对的第二轮PCR扩增后再作判