紫外-荧光检测器.pptx

紫外、荧光检测器 肖 雪 目 录 紫外检测器 荧光检测器 白炽透明的太阳是由波长小于10nm到1011nm的一组电磁波组成。 1、光-波长 2、什么样的物质有紫外、可见吸收 分子的电子结构和分子吸收光后电子状态的变化等可用分子轨道理论说明，分子轨道在任何情况下都是成键轨道比反键轨道稳定。电子跃迁发生在基态分子轨道（成键）和反键轨道之间，处于基态的电子吸收一定能量的光子后，可发生 σ- σ*、 σ-π*、π-σ*、π-π*、n-σ*、n-π*、各跃迁所需能量不同。 2、什么样的物质有紫外、可见吸收 1、σ- σ*所需能量最大，不易激发，如饱和烃，只含有σ键，其跃迁出现在远紫外区，波长小于200nm，例如AmaxCH4=125nm等。 2、n-σ*跃迁，杂原子O、N、S、X都含有n非键轨道，如C-Cl，C-OH等都发生n-σ*跃迁，其跃迁所需能量比σ- σ*小 但是主要还是在200nm以下。 3、n→π*跃迁，只有分子中同时存在杂原子（有n非键轨道）和双键π电子时才有可能发生n-π*跃迁，如C=O，N=N，N=O等，其吸收能量小，大部分在200~700nm之间，但是εmax较小，是弱吸收。 4、π-π*跃迁是双键中π电子由π成键轨道向反键轨道的跃迁，能量比n→π*跃迁大，比n-σ*小，因此这种跃迁也大部分出现在在近紫外区，其εmax较大，大多数是强吸收峰。根据π-π*产生的体系不同，吸收带可表示以下几种： （1）、共轭非封闭体系中的π-π*（K带）如丁二烯CH2=CH-CH=CH2，λmax=217nm。 （2）、B带（苯吸收）芳香族和杂环芳香族化合物光谱的特征吸收。芳环的B带吸收在230~270nm，如苯乙烯，λmax=244nm、λmax=282nm。 （3）、封闭共轭体系（如芳香族和杂环芳香族化合物） 苯丙氨酸（Phe，F） λmax = 257nm 酪氨酸（Tyr，Y） λmax = 275nm 色氨酸（Trp，W） λmax = 280nm 3、紫外检测器 发射紫外光的灯（汞、氘、氙灯） 选择波长 原理：光源发出的光通过棱镜分解折射出不同波长的光，经过狭缝调节后，只能让对某组分有最大吸收波长的光通过狭缝照射到样品上，样品池中的组分吸收了该波长的光，使其通过样品池后强度下降，使得检测器中的光电敏感元件输出电流发生变化，这种改变就是测定的结果，这种改变符合比尔定律。 3、紫外检测器 原理：双光路一路是样品池，一路是参比池，两路对等，光源以完全相等的两束光投射到测量池和参比池上，若两池中都是纯流动相（有的参比池中充满空气作为参比物），它们的吸收值是相等或几乎没有吸收，则两光照射到光电敏感器上的强度相等，无信号输出。即使有噪音也相互抵消，基线平稳。当有组分进入样品池，吸收紫外光使两边的光电敏感接受到的照射强度不等，像天平失衡，电路上着重电泳补偿，于是有信号。 优点：有了参比池可以减小紫外检测器的噪声，抵抗外来干扰，提高检测器的灵敏度 3、紫外检测器 棱镜发在样品池后，不需要在棱镜后加狭缝 检测器是排成 一组阵列的二极管，如256个二组管，每个可看成一个单元。 被测定组分通过样品池后照射到多色器上被分解折射成不同波长单色光。每个二极管都接收到波长不同，强度不等的光，被测组分通过样品池后的吸收紫外光的情况能够由多色器全波长分解扫描表现出来，不需要设定特定的波长。 二极管阵列检测器可显示三维色谱图，能够检查色谱峰的纯度。可同时进行多波长测定。重现性好。但是灵敏度一般你于普通的紫外检测器。 4、荧光检测器 吸收能量的分子中的电子被激发从低能阶到高能阶，在跃迁的过程中电子吸收了能量使紫外光的强度降低。这是紫外吸收的原理。 如果电子吸收了多余的能量，冲出了紫外吸收的范围到达更高的能阶，在回到低能阶的路途中因与其它分子的碰撞或其它原因，这些高能电子不会很快消失，当它们到达一个特定的次高能阶时，一下子降到一个特定的次低能阶，这个过程发出的光就是荧光，亦称发射荧光。 λ发射荧光＜λ激发荧光（电子撞击失去一部分能量） 激发荧光能阶≈紫外吸收的能阶 举例：糖基化：激发波长260nm，发射波长420nm 4、荧光检测器 荧光检测器多采用90°角的光路，这样避开了激发光和发射光之间的干扰。所用灯与紫外检测器一样，一般用氙灯，也是光电倍增管作为敏感器。 优点 ? 有极高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度约为紫外的10~1000倍。 ? 需要的样品最少 一定是这类化合物的分子中的电子被激发后能吸收多余能量达到更高能阶，所以才能用荧光检测器检测。 谢 谢 大 家！