沙门氏菌基因检测方案.pdf

天将降大任于斯人也，必先苦其心志，劳其筋骨，饿其体肤，空乏其身，行拂乱其所为。——《孟子》

材料：

操作步骤：

一、细菌接种

将提取到的沙门氏菌菌液取一环在XLD培养基上培养，培养一段时间后，从XLD培养基

上用接种环取一个单菌落接种于三糖铁斜面培养基上，培养一段时间后，从三糖铁培养基上

用接种环取一环细菌接种于肉汤培养基上，再进行一段时间的培养。

二、细菌DNA提取

从肉汤培养基中取一定量的菌液装入EP管中，离心，去上清，加入双蒸水，沸水浴、冰水

浴，离心，取上清。

三、PCR

（一）、引物设计

1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位

置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用PrimerPremier5搜索引物

①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列

在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗

口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，

进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在

SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产

物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认

按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引

物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基

相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm

应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要

相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，

发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结

构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些

二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，

所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，

是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然

带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.

⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后

在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面

有该引物的详细信息。

3、用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该

天将降大任于斯人也，必先苦其心志，劳其筋骨，饿其体肤，空乏其身，行拂乱其所为。——《孟子》

序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口

和Tm窗口。在T