三种基因编辑工具-ZFN.TALEN.CRISPR-Cas.pptx

基因编辑技术—ZFN、TALEN、CRISPR/Cas;基因编辑的三大利器;ZFN原理;TALEN;TALEN原理;全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 NG可以识别T HD可以识别C NI可以识别A NN可以识别G或A 通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。;TALEN的特异性打靶的原理： 一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域； 然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB）； 再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。 FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。 ;;TALEN的技术特点;CRISPR/Cas系统;CRISPR/cas系统的发现;2007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力。（Science, 23, 2007, p1650） 德国学者机制研究：Helmholtz、Doudna和、Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统（ CRISPR associated systems, cas）进行了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。;CRISPR/Cas原理;CRISPR/Cas系统分类;PAM：NGG;CRISPR/Cas9系统优势;基因活性调控功能 : 免疫系统不宜发现细菌细胞膜脂蛋白成分。因此，该系统除切割噬菌体基因以外，还具有调节细菌基因表达的能力，这是一项新发现。有CRISPR系统的细菌致病力较强。（TimEmory Univ研究显示，细菌感染哺乳动物细胞时，其CRISPR基因可关闭脂蛋白合成。因此othy R. Sampson, David S. Weiss et al. A CRISPR-CAS system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature, 14 April 2013 ） Qi等改造Cas9蛋白，其在向导RNA介导下与特定的DNA序列结合，但不切断DNA链，类似于RNAi技术 。在细菌中表现为抑制基因转录，但在哺乳动物细胞内，如在Cas9蛋白上添加了一个抑制子，可抑制基因的活性，此时向导RNA主要与靶基因上游的调控序列——启动子区域结合，类似于RNAi技术，能够以可逆的方式使基因失活 ;CRISPR/Cas系统的应用;科学院遗传???高彩霞团队：成功地使四种水稻基因失活（Nature Biotechnology, 2013） 在模式生物中的应用:成功地对线虫（左）、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明CRISPR技术在动物基因改造方面有巨大应用潜力。 美国加州大学旧金山分校（UC San Francisco）的Lei S. Qi等人与Doudna合作，发明了类似于RNAi技术的 CRISPRi技术，能够以可逆的方式使基因失活，这种技术在研究基因功能方面潜力巨大。 ;CRISPR/Cas9技术方案;CRISPR/Cas9表达策略;CRISPR/Cas9的特点和优势;CRISPR技术存在问题和解决方案;火爆程度 ;应用前景;Thank You!