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药物分析方法开发经验总结

一、常规化合物：

首先，看化合物是否有紫外吸收（这里的紫外吸收包括较微弱的紫外吸收，例如化合物只含有Boc基团、只有少量碳碳双键，或同时含有少量不饱和键与Br原子等）；若有紫外吸收，且没有对水很敏感的基团（在HPLC中会水解），则暂定使用HPLC进行分析；若无，且沸点不是太高（400℃以下）的话，则暂定使用GC进行分析。

备注：若紫外吸收太弱，例如：只有在200nm波长下才能出峰，峰高很低且峰型较差时，可根据化合物的沸点和性质选择使用LC-ELSD/CAD/MS检测器或用GC进行分析。此处如果是单纯看中控转化率，该方法也可以使用，此时需要尽可能降低背景吸收（采用磷酸或磷酸盐-乙腈的流动相体系），但如果是最终产品需要测定化合物的纯度，这种做法就不行了。

二、常见的几种情况如下：

1.?对于有紫外吸收的化合物，需要进一步看化合物的性质，特别关注的点有：化合物的pKa（酸碱性），化合物的logP（极性）以及化合物在酸、碱性条件下是否会水解。若化合物会水解，则需要考虑其他检测方法。

（1）若化合物为酸性，则需要使用酸性流动相（在水相中加入甲酸，三氟乙酸，磷酸，高氯酸等），一般从0.05%~0.1%的浓度开始；或者可以使用缓冲液（浓度一般从5~10mM开始，如磷酸盐，碳酸铵，甲酸铵，乙酸铵等，采用磷酸/甲酸/乙酸/三氟乙酸调pH至酸性）。刚开始可采用甲酸/甲酸铵/乙酸铵-乙腈体系作为流动相以适配LCMS；

（2）若化合物为碱性，则需要使用偏碱性的流动相（磷酸钾，碳酸铵，甲酸铵，乙酸铵，磷酸氢铵，三乙胺/二乙胺水溶液等，有需要的话还可以用氨水或三乙胺调pH至碱性）。刚开始可采用10mM甲酸铵/乙酸铵水溶液-乙腈体系作为流动相以适配LCMS；

（3）有机相首选乙腈（截止波长低，粘度小，洗脱能力较强），如果分离出现问题或者样品在乙腈中会坏掉，再选择甲醇。如果还有分离不开的现象，有机相可以采用乙腈，甲醇与THF中的任意两种进行混合，调整混合的比例以得到合适的分离度。

（4）若化合物为中性，则首选10mM醋酸铵水溶液，也可以换成水作为流动相（仪器设备紧张时），但水作为流动相不太建议，除非能够保证方法开发，验证以及转移阶段用到相同性质的水，否则不同的纯化水可能会具有不同的pH。

（5）对于液相色谱柱的选择，通常都从常规C18色谱柱开始尝试，同时需要注意色谱柱pH的耐受范围。对于某些特定结构的化合物，还可以使用苯基柱，氰基柱，氨基柱，五氟苯基柱，HILLIC色谱柱（化合物极性大的时候可以尝试使用，此时需要特别关注该类色谱柱的使用说明）等特殊色谱柱。

（6）当HPLC分析方法中分离度不好时，首先尝试调整梯度（同时将梯度变陡或者变缓）。如果调整梯度有分开的趋势，则可以继续尝试，如果没有，则需要考虑更换色谱柱或者流动相。此时需要根据化合物特定的基团来进行评估。比如化合物结构中苯环或类似结构较多，可采用苯基柱；若卤素元素较多，可采用五氟苯基柱等。

（7）液相色谱柱，当填料相同时，内径越细，颗粒粒径越小，得到的分离度、灵敏度以及色谱峰的塔板数会越高（峰会变得更高更瘦）。但此时压力会上升。需要根据需求选择HPLC或UPLC，同时需调整流速。

（8）在液相分析中，有一种类型的化合物（带醛基的化合物）比较特殊，有时候会出现峰型展宽的现象。这可能是由于化合物会出现醛基和烯醇基互变的现象，此时可以尝试60℃的柱温以及采用高氯酸或强碱性（pH9~11）的流动相，用以改善该类化合物的峰型。

2.?对于没有紫外吸收的化合物，若沸点在400℃以内（根据数据库查询到的数值）且高温下不会分解，结构不会发生变化，则可采用GC进行分析。后续根据化合物的特性基团、极性大小以及沸点高低，选择合适的色谱柱以及气相色谱仪的参数。

（1）带氨基的化合物，可根据极性不同采用Rtx-5Amine、CP-Volamine（低极性）、Rtx-35Amine（中等极性）以及CP-51WaxforAmine（高极性）等色谱柱。

（2）酸和醇类的化合物一般极性较大，可采用DB-FFAP（酸），HP-INNOWAX等色谱柱进行分析。

（3）普通化合物：可采用DB-1和HP-5（低极性）、DB-1701（中等极性）以及DB-WAX和HP-INNOWAX（高极性）色谱柱进行分析。

（4）盐酸盐类化合物：由于盐的沸点非常高，此时可采用吸附树脂或DBU的甲醇/乙腈溶液将盐酸盐除掉，然后将游离态（不带盐酸盐的化合物）进气相进行分析。也可以用液碱（氢氧化钠/碳酸氢钠水溶液）去除盐酸盐，之后采用有机溶剂对溶液进行萃取，将脱掉盐酸盐的化合物萃取到有机相中，进GC进行分析。

（5）若化合物沸点超过了柱子的最大耐受温度，并不是不可以分析，因为在GC的载气以及高压条件下，化合物的沸点会有所降低。此时可