Ki-67阴性结直肠癌细胞的增殖和自我更新能力的研究.pdf

第 44卷第 2期第 134页 华中科技大学学报 (医学版) Vo1．44 No．2 P．134 2015年 4月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Apr． 2015 Ki一67阴性结直肠癌细胞的增殖和 自我更新能力的研究* 颜 畅 ， 胡艺冰 ， 穆 磊 ， 黄开禹 ， 覃吉超 华中科技大学同济医学院附属同济医院 分子医学中心 甲乳外科 ，武汉 430030 摘要 ：目的 观察结直肠癌 中Ki一67阴性(Ki-67 )细胞在肿瘤增殖及 自我更新 (self—renew)中的作用 ，探讨将 Ki一 67 作为分离肿瘤干细胞标记物的应用。方法 通过将人结直肠癌标本消化成为单细胞，感染Ki一67启动子驱动GFP 表达(pKi一67一GFP)的慢病毒后，注射至NOD／SCID小鼠背部建立 pKi一67一GFP结直肠癌移植瘤模型；用流式细胞仪从移 植瘤 内分离出GFP EpCAM 细胞(Ki一67 癌上皮细胞)和 GFF／lowEpCAM 细胞 (Ki-67f／癌上皮细胞)，并采用免疫 印 迹验证 Ki一67的表达 ；用流式细胞仪检测 Ki一67 的细胞周期 ；采用 PKH26标记细胞后 ，根据滞 留细胞分析其在体 内的 增殖能力；采用荧光定量PCR(qPCR)研究Ki-67细胞中CD133、CD44和 Lgr5等肿瘤干细胞相关基因的表达水平，并用 成球实验研究 Ki-67 结直肠癌细胞的自我更新能力。结果 从新鲜人结直肠癌移植瘤中分离出GYP EpCAM 细胞 和GFF EpCAM 细胞 ，Westernblot检测显示 GFP EpCAM 细胞高表达 Ki-67，GFF／】EpCAM 细胞不表达 Ki一 67；细胞周期检测显示 ，(82．25士3．16) 的Ki-67 细胞在 Go／G 期，(51．67±4．11) 的Ki一67 细胞在 Go／G1期 ，体 内PKH26标记滞留实验显示Ki-67 和Ki-67细胞分别含 (81．53±5．85)％和(4．57士1．05) PKH26阳性细胞 ，差 异有统计学意义 (P0．01)，提示 Ki一67_， 细胞主要是 Go／G 期细胞 ，在体 内处于慢增殖状态 ；荧光定量 PCR证 明Ki一 67_，细胞 CD133、CD44和 Lgr5的mRNA水平为 Ki一67 细胞 的(3．47士0．79)、(6．18±1．65)和 (4．67±1．15)倍 ，差异 有统计学意义 (PO．05)，体外成球实验 ，Ki-67 及 Ki一67 细胞 的成球数量分别为 (83．00±9．54)和 (8．0O¨±2．66)(P O．01)，提示Ki-67 细胞高表达 CD133、CD44和 Lgr5等肿瘤干细胞相关标记物，并具有显著的自我更新能力，富集 肿瘤干细胞。结论 Ki一67阴性的结直肠癌细胞具有慢增殖的特点，较Ki一67阳性结直肠癌细胞具有更强的成球能力， 在结直肠癌的自我更新中起重要作用，并有可能作为肿瘤干细胞的标记物。 关键词 ：Ki一67； 结直肠癌 ； 慢增殖 ； 自我更新 ； 肿瘤干细胞 中图分类号 ：R735．3 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2015．02．002 Proliferation andSelf-renewalCapacityofKi-67一。。 ColorectalCancerCells YahChang ，HuYibing。，Mu Leietal MolecularMedicineCenter，DepartmentofThyroidandBreastSurgery，TongjiHospital， Ton}gjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China Abstract Objective Toinvestigatetheproliferationandself—r