玉米赤霉烯酮ELISA说明书.doc

玉米赤霉烯酮ELISA快速检测试剂盒操作说明书 简介 本试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附ELISA原理快速定量检测谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮（ZearaLenone,ZEN）。 谷物/饲料的前处理包括：提取、过滤、稀释，处理时间大约为20-40分钟。 本试剂盒的检测限为：10 ppb；谷物/饲料中ZEN的回收率 ≥80%；批内、批间变异系数15% 。 A. 24/48/96孔ZEN酶标板: 3/6/12条×8孔 B. 20×浓缩洗涤液：25mL (用蒸馏水稀释20倍使用) 1瓶 C. ZEN抗体: 3/6/12mL 　　 1瓶 (红盖)D. 酶标二抗： 3/6/12 mL 　　　　　　 　 1瓶 (绿盖) E. 显色液：3/6/12 mL 1瓶 (蓝盖) F. 终止液:3/6 mL 　 1瓶 (黄盖) G. ZEN标准品:1.5/2mL/瓶（0、30、60、200、500ppb）1瓶 H. 操作说明书 1份 注意：标准品含有低浓度ZEN、终止液含2 N H2SO4，需小心取用；勿在有效期外使用本试剂盒。 2-8℃避光贮存，忌0℃以下冻存，有效期见试剂盒内盖。 实验准备：配制60%甲醇水溶液（v/v60:40）和20%甲醇水溶液（v/v20:80）注意：请精确配制上述溶液，以免影响检测的准确性。 称取5 g 具有代表性的粉碎样品于100 mL带塞三角瓶内，准确加入25 mL 60%甲醇水溶液。 将加入了甲醇水溶液的样品放入振荡器内（或用手强力振荡），充分振荡3分钟后，用whatman 1号滤纸过滤，收集滤液。 取滤液2mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，用whatman 1号滤纸过滤，此为样品待检液。 注意： 某些样品待检液(如花生等)久置影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品提取后请即时检测。 若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2-8℃避光保存。 试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室温（20-25℃）进行温度平衡。试剂用完后立即将其放置回2-8℃冰箱内保存。 在每个步骤操作时，速度要快，不要使板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于自封带内，防止受潮且避光保存于2-8℃冰箱内。 在温育时，避免光照，建议将酶标板置于内进行温育。 若样品数量超过20份，请用多通道加样器操作。 5.1 实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开自封袋，取出所需数量的板条插入微孔架，记录空白、ZEN标准品①②③④⑤号及样品的位置（下表所示）。其余板条封口后放入冰箱。将20×浓缩洗涤液稀释待用。 1 2 3…12 A 空白 样品 B 标准品① 样品 C 标准品② 样品 D 标准品③ 样品 E 标准品④ 样品 F 标准品⑤ 样品 G 样品 样品 H 样品 样品 ：空白孔加入100 μL 洗涤液(不加ZEN抗体)。ZEN标准品孔和样品孔相应地加入标准品(①②③④⑤)和样品待检液各50 μL/孔（如上表所示加入），再加入ZEN抗体(50 μL /孔)，此时各孔中溶液体积为100 μL。将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出），使之混匀，放入内37℃温育30分钟。注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样须更换新的吸头。 洗板：甩出孔中的液体，用洗瓶或移液器将洗涤液加入各孔中(满孔)，再次甩出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次(共洗四次)。 加酶标二抗：将洗好的酶标板平放，加入酶标二抗100 μL /孔，置于内，37℃温育30分钟。 洗板：参照5.3 显色：将洗好的酶标板平放，加入显色液100 μL /孔，37℃显色5分钟(若显色较浅，可适当延长，但不宜超过10分钟)。 终止及测定：将显色完毕的酶标板取出，加入终止液50 μL/孔，轻微震荡混匀，以空白孔调零，在450 nm处测量吸光值A（在加入终止液5分钟内读取吸光值）。 结果判定：以ZEN标准品浓度30ppb、60ppb、200ppb、500ppb的常用对数值（1gC）为横坐标，各浓度标准品相应的吸光值A与0ppb的标准品A值的比值(B/B0%)为纵坐标[B/B0%=标准品（或样品）的吸光值/0ppb标准品的吸光值×100%]，绘制标准