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喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定 刘兆颖，陈冬梅，袁宗辉 华中农业大学国家兽药残留基准实验室 喹乙醇（olaquindox ），又名倍育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，能促进动物生长，提 高饲料转化率，具有广谱抗菌作用，可以预防猪的大肠杆菌和痢疾。但由喹乙醇具有生殖毒性、 致突变性和光毒性，因被禁止或限制使用。 目前国内外对喹乙醇的代谢研究很少，Spierenbur 等（1988）用 HPLC 检出了猪胃肠道中 喹乙醇的三种还原代谢物，即 N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇。JECFA 报道猪 口服喹乙醇(2mg/kg b.w)后，24h 内就消除了药量的90%，其中 70%是以原形从尿液中排出，血 浆最大浓度出现时间是 1-2h，表明喹乙醇吸收快，消除也快。给药2 天后，检测组织中的放射 性，发现肝脏和肾脏分别残留 52 和 110μg/kg，肌肉为 9μg/kg，。尿液中存在N1-还原喹乙醇、 N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇和三种羧酸衍生物，其中 3- 甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA ）在体 内消除缓慢，因而被规定为肝肾组织的残留标识物。因此为了更好地了解喹乙醇的代谢特征， 本文先用体外代谢方法对其代谢进行研究。 肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下 进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。肝微粒体体外温孵法与其他的体外肝 代谢方法相比，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢 样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实 际工作中应用较为普及。本文就用大鼠肝微粒体来研究喹乙醇的体外代谢，对其代谢产物的鉴 定就用高灵敏度、高质量精度和多级质谱的 LCMS-IT-TOF 联用技术，首次发现了一些没报道 的新代谢产物，完善了喹乙醇的代谢途径，为喹乙醇的毒性研究和残留监控提供了重要的指导 意义；同时，为喹噁啉类其它药物的代谢研究提供了重要的参考价值。 1. 实验材料 1.1 标准品及标准溶液配制 喹乙醇，含量 99.8%，中国兽医药品检查所，批号H050204 ； 喹乙醇储备液：准确称取 26.3mg 喹乙醇于 10mL 容量瓶中，用少量超纯水溶解，再用甲醇 定容使之成为 10mmol/L 的储备液，4 ℃冰箱避光保存； 脱二氧喹乙醇，含量 98% 以上，华中农业大学兽药研究所合成，批； 脱二氧喹乙醇标准储备液：准确称取 23.2mg 喹乙醇于 10mL 容量瓶中，用甲醇定容使之成 为 10mmol/L 的储备液，4 ℃冰箱避光保存。 1.2 试验动物 7 周龄 Whister 雄性大鼠，体重 167g-185g，购自湖北疾病预防控制中心实验动物房。实验 前禁食 12h，期间自由饮水。 1.3 试验仪器和设备 电子天平，感量0.000001g，日本 SHIMADZU 公司； 隔水式电热恒温培养箱，303AS-3 型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司； 79 日立CS120GLS 超速冷冻离心机； HITACHI HIMAC CR 21G 高速冷冻离心机； Agilent 8453E 紫外可见光谱仪； 意大利 Angelantoxi Polar 530 超低温冰箱； 美国 Millipore-Q 超纯水仪； 日本LCMS-IT-TOF ，配 SPD-M20A 二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3 自动脱 气装置、SIL-20AC 自动进样器和CTO-20AC 柱温箱，LCMS solution Chemstation 工作站。 1.4 试剂及溶液配制 乙腈，色谱纯，Fisher ，批号 064510 ； 甲酸，分析纯，上海试剂一厂，批； 氯化镁，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号 ； 蔗糖，Amresco ，批号，3073B95 ； 低亚硫酸钠，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号 ； 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠（NADP+ ）Roche ，批号2006828 ；