人外周血单核细胞分离技术.pdf

人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL 于 50 mL 离心管中，以 2 000 r /min 离心 20 min，吸弃上层血浆，获得 下层沉淀细胞约 10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 2+ 2+ A 中的细胞中加入Hank′s 液 ( 不含 Ca 、Mg , pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未 1:1， 混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与 Hank′s 液或 PBS 以 1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入 LTS1077 淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上 1cm 处将 细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分 离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心 20min，离心结束后，取 出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为 4 层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出 PBMC。加 3~4 倍以上体积 Hanks 或 PBS 液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀， 避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 ／3。混匀后离心 1500r/min离心 10min，低速离 心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分 慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞 2 次，1500r/min 离心 10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。 再以 RPMI-1640 培养基离心洗涤 1 次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血 液标本加 0.2 mL 含 20%小牛血清的 Hank′s 液( 或含 10%胎牛血清及 25 mmol /L hepas 的 RPMI-1640 液 3～4 mL) 重新混悬细胞 37℃、5% CO2 孵育箱中培养 2 ～3 h 后去除上清，得 到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 液 3～4 mL，按需调 定细胞密度, 于 37℃、5% CO2 孵育箱中培养备用。 4. 单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定 取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56 等检查,以测定所得细胞的纯度。取 1 滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加 1 滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染 成蓝色，体积略膨大。 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部 来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）