眼球石蜡包埋制作方法改良.doc

石蜡包埋制作猫眼球切片方法改良 张祥令，苏 敏*，黄 悦，胡 蓉，李 红，许爱萍 （550004 贵阳，贵阳医学院组织学与胚胎学教研室） 【摘 要】目的：探讨和改良石蜡包埋制作猫眼球切片方法。方法：取健康猫眼球10只，AFA（甲醛-乙醇-冰醋酸）固定液固定，乙醇梯度脱水，氯仿透明，石蜡包埋制作眼球切片，厚度7μm，HE染色，观察并记录。结果：（1）石蜡包埋的猫眼球不变形，外观无明显收缩，结构完整，可获得整个眼球；（2）HE染色切片观察，眼球壁各层结构清晰，角膜、角膜缘、巩膜静脉窦、睫状肌等组织结构完整，视网膜无明显剥离、层次清楚，各层细胞排列整齐、容易辨认。结论：采用此方法对猫眼球进行石蜡包埋，可获得较满意的眼球组织切片。 【关键词】眼球；石蜡包埋；改良；猫 眼球的结构外形近似球体，外层巩膜是致密的结缔组织，内层视网膜很柔软，容易剥离脱落，眼球腔中还有一个很硬的晶状体，其制作过程在组织学上是难点[1-2]。一般认为，制作眼球不宜用石蜡切片，因其可使眼球结构变硬变脆，因此常用火棉胶包埋切片[3]。传统用火棉胶包埋时，费时至少要三月，试剂易燃，毒性强，成本高，不能连续切片，切片较厚。而常规石蜡包埋切片，眼球易变硬变脆变形，视网膜容易剥离，不利于教学切片补充和组织病理学诊断[4-8]。本室通过反复试验，不断改良石蜡包埋制作切片技术，尤其是在固定剂、脱水剂、透明剂等方面进行改良，取得满意效果，在保证获得搞质量的眼球切片的同时，还较显著地缩短了实验时间，为眼球切片的制作提供了较好的方法。 1 材料与方法 1.1 取材固定：用50ml注射器由耳缘静脉注入空气栓塞致死实验健康成年猫，速取眼球，小心除去周围的结缔组织，投入垫有脱脂棉的AFA固定液（20％甲醛40ml，95％乙醇60ml，冰醋酸5ml）进行固定，间隔6h换同等量AFA固定液固定，共固定18h。 1.2 脱水透明：乙醇梯度脱水：70％乙醇和80％乙醇各12h，90％乙醇和95％乙醇各10h，100％乙醇液体和半乙醇半氯仿中各8h，在透明剂氯仿中过夜直至包埋；脱水时，严格控制不同梯度乙醇的浓度和进入下一步乙醇时用滤纸吸干，使组织脱水更彻底。 1.3 浸蜡包埋：石蜡和氯仿按1:1比例混合浸蜡2h，纯蜡（1）1.5h，纯蜡（2）1.5h，包埋成蜡块，室温冷却待切。包埋时，石蜡要处于半溶状态，严格控制包埋机温度56~60℃，有利于标本浸蜡。 1.4 切片：用徕卡轮转式切片机切片7μm, 用徕卡贴片机40℃展片，40℃温箱烤片4d。 1.5 染色：常规HE染色，化蜡，染色，上行，二甲苯透明，中性树胶封片。 1.6 用传统火棉胶包埋猫眼球切片进行对比[3]。 2 结果 2.1 肉眼观察 经过上述改良的方法进行石蜡包埋，眼球不变形，外观收缩不明显，结构完整，可获得整个眼球（图1）；切片容易，获得较薄的石蜡切片，厚度约7μm。眼球角膜从前至后5层（角膜上皮、前界层、角膜基质、后界层、角膜内皮）结构排列整齐（图2）。 2.2 HE染色观察 眼球角膜从前至后5层（角膜上皮、前界层、角膜基质、后界层、角膜内皮）结构排列整齐（图2）；而传统火棉胶包埋的眼球切片较厚，角膜上皮多层细胞重叠，界限不清楚（图3）。 眼球切片完整，眼球壁各层结构清晰，巩膜静脉窦、睫状肌、角膜缘上皮等组织结构完整（图4）；视网膜无明显剥离、层次清楚，各层细胞排列整齐、从外向内可清晰辨认色素上皮层、视细胞层、双极细胞层、节细胞层四层细胞（图5）。而传统方法制作的切片较厚，可辨认四层细胞，但每层细胞轮廓不清（图6）。 图4 光镜观察角膜缘上皮，层次清晰 HE×1000 图5 光镜观察视网膜各层结构清楚，无脱落 HE×400 图6 光镜观察视网膜，细胞重叠，界限不清 HE×400 3 讨论 眼球切片制作是组织切片技术上的难题，传统用火棉胶包埋，需要一个长时间的火棉胶浸制过程，使用滑动切片机切片，不能连续切片，染色要在培养皿进行片染，染色后使用捞片方法，其制作较为困难复杂，存在周期较长，而且材料要求特殊，易燃，有毒性等缺点，获得的切片较厚，也不利于眼球壁组织结构的观察[1-8]。为了解决这一系列的问题，本实验室采用改良的石蜡切片制作方法获取眼球切片，取得了满意的效果。本方法在整个过程仅用10d左右，相比传统的火棉胶包埋法所需3个月的时间，大大缩短了实验的进程，节约了实验时间，提高了效率。其次，本实验均使用常规试剂，较为容易获得，不需特殊的保存，使用方便；获得的切片较薄约7μm，与传统火棉胶包埋切片的（15～20）μm相比，镜下结构重叠现象不明显，尤其是角膜缘上皮清晰可见，针对现在干细胞生物学特性的研究热点，可有效进行角膜缘干细胞的原位定