谱技术在临床常见呼吸道病原菌检测和鉴定中的应用进展.doc

谱技术在临床常见呼吸道病原菌检测和鉴定中的应用进展 　　质谱（mass spectrometry）技术是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，可用来分析同位素、元素成分及有机物构造等。质谱仪最早的临床应用主要在于检测一些生物标记物以帮助诊断癌症和遗传疾病等。20 世纪80年代，日本岛津公司的田中耕一发明了基质辅助激光解析电离（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）技术，使得质谱能够检测生物大分子[1，2]，该发明在2002年荣获诺贝尔奖。质谱技术的诞生和发展奠定了用蛋白质指纹图谱鉴定微生物的基础，通过检测未知微生物的蛋白质指纹图谱并与质谱图数据库中特征性谱图进行比对，从而对待测微生物进行快速鉴定。由于测定的图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度，且表达稳定、进化保守的核糖体蛋白，因而此法不但鉴定结果精确度高，且能借助聚类剖析获取微生物间的进化与亲缘关系。 　　1 鉴定原理 　　MALDI-TOF MS的作用机理是把微生物样品同等量基质溶液联合或分别加入样品靶盘中，溶剂挥发后产生共结晶；借助激光辐射结晶体，基质吸收激光能量使样品吸附，产生电荷转移后游离样品分子，样品离子于加速电场下得到动能，继而进行质量评估，将离子峰与离子质荷比设为纵横坐标，产生质量图谱；通过软件分析比较，筛选并确定出特异性指纹图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[3]。该技术具有速度快，灵敏度高，操作简单，信息直观，成本低廉等特点，在对病原微生物进行快速鉴定方面具有良好的应用前景。 　　2 质谱仪在临床常见呼吸道病原菌鉴定中的应用 　　1996年，HOLLAND等[4]首次报道了细菌不经前处理直接进行质谱分析，可得到完整细胞的MALDI-TOF MS指纹图谱。KRISHNAMURTHY等研究人员用质谱顺利完成了对细菌种属水平的鉴定。在质谱技术逐渐成熟期间，相关MALDI-TOF MS高效、精确鉴定的研究报道也逐渐变多。当下，临床应用最广的质谱仪是MALDI BioTYPER TM（Bruker Daltonics），SARAMISTM（Shimadzu Anagnostec）和MALDI micro MXTM（Waters Corparation）、VITRK MSTM（BIOmERIEUX）。其中，MALDI BioTYPER TM于2011年荣获欧洲CE认证；VITRK MSTM于2011年荣获欧盟体外诊断认证及美国FDA准入，且在2012年8月通过SFDA批准，这就意味着MALDI-TOF MS质谱技术将在临床微生物诊断中获得广泛应用。 　　2.1常见呼吸道细菌鉴定 大量文献报道，MALDI-TOF MS对细菌鉴定到种属水平正确率较高，报道了临床呼吸道中的常见的铜绿假单胞菌、嗜血杆菌肺炎链球菌大肠埃希氏菌和葡萄球菌等重要病原菌成功鉴定的实例，体现了这一技术在临床病原菌鉴定中的应用前景。质谱用于细菌鉴定正确率高，应用范围广，且方法和配套数据库较为成熟。 　　Microflex LT（BioTyper）和Vitek MS IVD（Vitek MS）两种质谱系统分别鉴定986 株临床需鉴定到种水平的细菌，结果显示BioTyper与Vitek MS的鉴定正确率相当，分别为97.2%和93.2%（P=0.608）[5]，大多数用MALDI-TOF MS不能正确鉴定的都是一些相近的菌株。Blondiaux等[6]也得出类似结论。且不同质谱系统对同一类型细菌的鉴定精确度也不尽一致。 　　Eigner 等[7]报道了对1116株临床分离菌和108株标准菌株的回顾性分析。通过MALDI-TOF MS Bio Typer 数据库同传统细菌鉴定进行对比，得出对标准菌株鉴定的精确度是93.5%，临床分离株的鉴定精确度是95.2%，对肠球菌、葡萄球菌、肠杆菌、链球菌、不发酵革兰阴性杆菌的鉴定精确度依次是100%、99.5%、95.5%、93.7%和79.7%. 　　嗜血杆菌的鉴定一直是临床微生物实验室的难题，临床实验室鉴定主要依赖手工方法，MALDI-TOF MS的应用使嗜血杆菌鉴定变得更加简便且快速。BioTyper与Vitek MS对流感嗜血杆菌的鉴定精确度都是100%，但二者对副流感嗜血杆菌的鉴定都不精确，2株菌株都鉴定失败[5]。实验室鉴别流感嗜血杆菌、溶血性嗜血杆菌的常规方法并不可取，溶血性嗜血杆菌常被鉴定为未分型流感嗜血杆菌，应用BioTyper 鉴定的精确度则是99.6%[7]。 　　在非结核分枝杆菌鉴定方面，国外学者对107株分枝杆菌临床分离株（包括结核分枝杆菌复合体），利用声波降解的热失活方法和利用玻璃珠进行细胞裂解的方法进行失活和提取，再利用MALDI-