单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的-现代食品科技.PDF

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2018, Vol.34, No.8 单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建 立及应用 王金凤 1,2 1,2 3 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 ，刘立兵 ，耿云云 ，石蕊寒 ，孙晓霞 ，南汇珠 ，姜彦芬 ，王建昌 （1.河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄 050000）（2.河北省检验检疫科学技术研究院，河北 石家庄 050051）（3.河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024） 摘要：本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ，LM ）的实时荧光重组酶聚合酶扩增 （real-time RPA ）方法。基于LMhlyA 基因保守序列，设计合成特异性 RPA 引物和exo 探针，所建立的LM real-time RPA 方法能够在 37 ℃等温条件下 20 min 内完成扩增。该方法仅对LM 基因组 DNA 为阳性扩增，对其它20 种致病菌基因组 DNA 的扩增均为阴性； 以LM 纯培养菌液的基因组DNA 进行 10 倍列梯度稀释，并以之作为模板，其灵敏性可达到 5×10-1 pg ，与实验室已建立的real-time PCR 方法一致。人工污染实验中，对于LM 接菌量为 3 CFU/25 g 的羊肉和生菜样品，增菌 14 h 即可通过建立的real-time RPA 方法检出， 与传统培养方法和real-time PCR 检测结果均一致，但是前者所需时间明显少于后者。本文建立的 LM real-time RPA 方法特异性强， 灵敏性高，操作简单，反应迅速，并能够摆脱对价格昂贵的荧光 PCR 仪和专业实验室的需求，可应用于食品突发事件中 LM 的现场 快速检测，对保障我国食品安全具有重要意义。 关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；real-time RPA；hlyA 基因；食品安全 文章篇号：1673-9078(2018)08-213-218 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2018.8.031 Development and Application of the Real-time Recombinase Polymerase Amplification Assay for Detection of Listeria monocytogenes 1,2 1,2 3 1,2 1,2 1,2 WANG Jin-feng , LIU Li-bing , GENG Yun-yun , SHI Rui-han , SUN Xiao-xia , NAN Hui-zhu , JIANG Yan-fen1,2, WANG Jian-chang1,2 (1.Center of Inspection and Quarantine, Heibei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050000, China) (2.Heibei Academy of Inspection and Quarantine, Shijiazhuang 050051, China)(3.College of Life Science, Hebei Normal Univer