DB21∕T 2465-2015 新城疫强弱毒株R∕T-PCR鉴别诊断技术.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 宁 省 地 方 标 准 DB 21/T 2465—2015 新城疫强弱毒株RT-PCR 鉴别诊断技术 Method of RT-PCR that Distinguishes Lentogen Strains From Virulent Strains of- Newcastle Disease Virus 2015 - 04 - 30 发布 2015 - 06 - 30 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2465 2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准由辽宁省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：吴运谱、顾贵波、石 霖、薛树山、杨作丰、王宏燕、马建山、闫海滨、何 欣、 王志国、张 爽 I DB21/T 2465 2015 新城疫强弱毒株RT-PCR 鉴别诊断技术 1 范围 本标准规定了新城疫强毒株、弱毒株的 TaqMan 实时荧光RT-PCR 检 方法。 本标准适用于禽类棉拭子样品、组织样品及相关样品的尿囊液的新城疫病毒强、弱毒株的检 。 2 规范性引用文件 下列文件对于 文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版 适用于 文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版 （包括所有的修改单）适用于 文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于 标准。 NDV：新城疫病毒 DEPC：焦炭酸二乙酯 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 BSA：牛血清白蛋白 RNA：核糖核酸 BP：碱基对 RT-PCR：反转录聚 酶链式反应 Taq酶：Taq DNA聚合酶 Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 4 原理 通过对大量强毒株和弱毒株的序列比对分析，设计其相应的引物及其探针。探针5′端标记 FAM 荧 光素为报告荧光基团 （用R 表示），3′端标记MGB 荧光素为淬灭荧光基团 （用 Q 表示），其在近距 离内能吸收5′端荧光基团发出的荧光信号。PCR 反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片 段结 ，此时探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到 延伸阶段时，Taq 酶的5′→3′的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的 R 基团游离出来，所发 出的荧光不再为 Q 所吸收而被检 仪所接收。随着 PCR 反应的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长 呈现对应关系。 5 仪器与器材 1 DB21/T 2465 2015 高速台式冷冻离心机