实验六 淋巴细胞功能检测.ppt

淋巴细胞功能检测 实验目的 掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理 基本概念 T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象，所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了解T细胞功能 T淋巴细胞（T-lymphocyte） T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。它是淋巴细胞的主要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，用以抵御疾病感染、肿瘤。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。 T细胞根据功能/表面标志分类 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这些细胞可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8。 辅助T细胞（helper T cell）：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。主要表面标志是CD4。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种如CD25+ CD4+ T细胞。 记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作用。 T细胞在体外培养时，受到非特异性丝裂原（如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞。 淋巴细胞增殖活力的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 刺激淋巴细胞增殖的物质 非特异性刺激物：植物血凝素（PHA ，刺激T细胞）、刀豆蛋白A（ConA，刺激T细胞）、PWM（刺激B、T细胞）、LPS（刺激B细胞）、抗CD3抗体等。 特异性抗原物质：异种抗原，同种组织抗原。 不同的刺激物质可刺激不同的淋巴细胞分化增殖，可以反应不同细胞群的免疫功能。 刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA) ConA属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面TCR复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性多克隆活化剂。 淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等形态变化。 淋巴细胞体外检测方法---形态检测法 主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。 优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复性较差 同位素渗入法 根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的转化程度。 优点：敏感性高，重复性好 缺点：需要特定设备，存在放射性污染 CCK8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖 Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由日本同仁化学研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8 试剂盒利用了日本同仁化学研究所（Dojindo）开发的四唑盐——WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。OD450可间接反映活细胞数量。 CCK8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。 该方法已被广泛用于一些