狐源犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的克隆与序列分析.docx

毕业设计（论文）

PAGE

1-

毕业设计（论文）报告

题目：

狐源犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的克隆与序列分析

学号：

姓名：

学院：

专业：

指导教师：

起止日期：

狐源犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的克隆与序列分析

摘要：犬瘟热病毒（CDV）是引起犬类严重疾病的病原体，其核衣壳蛋白（NCP）在病毒的生命周期中扮演着关键角色。本研究旨在通过克隆狐源CDVNCP基因，并对其进行序列分析，以揭示其结构和功能特性。首先，从狐源CDV中提取NCP基因并进行克隆，随后对克隆的基因进行序列测定和分析。结果表明，狐源CDVNCP基因编码一个具有典型核衣壳蛋白结构的蛋白质，其序列与犬源CDVNCP具有高度同源性。通过生物信息学分析，预测了狐源CDVNCP的二级结构和功能位点。本研究为深入理解狐源CDVNCP的功能提供了重要基础，并为CDV的防控提供了新的思路。关键词：犬瘟热病毒；核衣壳蛋白；基因克隆；序列分析；狐源

前言：犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，可引起犬类及其他哺乳动物发生多种疾病。CDV感染对犬类养殖业造成严重威胁，给全球养犬业带来巨大经济损失。近年来，随着犬瘟热疫情的频繁发生，研究CDV的分子生物学特性，特别是其核衣壳蛋白（NCP）的结构和功能，对于CDV的防控具有重要意义。本研究以狐源CDV为研究对象，通过克隆狐源CDVNCP基因并对其进行序列分析，旨在揭示狐源CDVNCP的结构和功能特性，为CDV的防控提供理论依据。

一、材料与方法

1.1狐源CDV的分离与鉴定

(1)狐源CDV的分离与鉴定是本研究的第一步，旨在从感染犬只的样本中获取病毒。通过采集疑似CDV感染犬只的血液、鼻拭子或粪便等样本，采用细胞培养技术，在犬源细胞系如MDCK中进行病毒分离。在细胞培养过程中，我们观察到细胞病变效应（CPE），这表明病毒在细胞内复制并引起细胞损伤。通过连续观察和病毒滴度检测，我们成功分离得到狐源CDV。

(2)为了确保分离得到的病毒确实是CDV，我们采用了多种鉴定方法。首先，通过免疫荧光试验（IFA），使用针对CDV核衣壳蛋白的单克隆抗体，对分离病毒进行直接检测。结果显示，在感染细胞中观察到明显的荧光信号，证实了分离病毒的CDV身份。此外，我们还进行了病毒基因组的RT-qPCR检测，通过特异性引物和探针，对CDV基因进行扩增和定量，进一步验证了病毒的CDV属性。这些鉴定结果表明，分离得到的病毒确实是狐源CDV。

(3)在完成病毒分离和鉴定后，我们对狐源CDV的生物学特性进行了研究。通过观察病毒对细胞培养的影响，包括细胞病变效应、细胞形态变化和病毒滴度变化等，我们评估了狐源CDV的致病性。此外，我们还对狐源CDV的感染周期、病毒颗粒形态和病毒复制过程进行了详细分析，为后续研究狐源CDV的分子机制奠定了基础。通过这些研究，我们获得了对狐源CDV更深入的了解，为后续的基因克隆和序列分析提供了可靠的病毒材料。

1.2狐源CDVNCP基因的克隆

(1)狐源CDVNCP基因的克隆是本研究的关键步骤，我们首先根据已发表的犬源CDVNCP基因序列设计特异性引物。通过RT-PCR技术，从分离的狐源CDV病毒中提取RNA，反转录合成cDNA，作为PCR模板。经过多次优化，成功扩增出狐源CDVNCP基因的编码区。随后，将扩增产物进行纯化，与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

(2)连接产物经过蓝白斑筛选，挑取白色克隆进行菌落PCR验证，确认阳性克隆。进一步，将阳性克隆送至测序公司进行测序，获得狐源CDVNCP基因的完整序列。测序结果经过拼接和比对，证实了克隆得到的狐源CDVNCP基因与预期序列一致。随后，我们将该基因片段亚克隆至表达载体pET-28a，构建表达质粒，为后续的蛋白表达做准备。

(3)表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，通过IPTG诱导表达狐源CDVNCP蛋白。收集表达蛋白，进行SDS电泳分析，观察蛋白表达情况。结果显示，成功表达了分子量与预期一致的狐源CDVNCP蛋白。通过蛋白纯化，得到高纯度的狐源CDVNCP蛋白，为后续的序列分析、结构预测和功能研究提供了重要材料。

1.3狐源CDVNCP基因的序列分析

(1)狐源CDVNCP基因的序列分析首先涉及基因序列的比对，我们使用BLAST工具将克隆得到的狐源CDVNCP基因序列与已知的CDVNCP基因序列进行比对，以确定其遗传关系。比对结果显示，狐源CDVNCP基因与犬源CDVNCP基因具有较高的同源性，表明狐源CDVNCP基因编码的蛋白在结构上可能具有相似的功能。进一步，我们分析了狐源CDVNCP基因的开放