透明质酸的离子交换层析纯化-透明质酸钠.PDF

透明质酸的离子交换层析纯化 倪杭生 李润 贺艳丽 罗敏 从动物组织或发酵液中提取的透明质酸(hyaluronic acid,HA)粗品都含有蛋白 质、核酸等杂质，需要分离纯化。离子交换技术已经成为分离提取生物大分子的 有效方法。与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。它用于 纯化HA 的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。有文献报道，采 用Amberlite IRA900 强碱型阴离子交换树脂，分离纯化制得高纯度HA，其蛋白 质含量为0.3%[1] 。本文选择经组氨酸修饰的强碱型阴离子树脂作为离子交换剂， 以增大 HA 及其所含蛋白质、核酸等各组份与交换剂相互作用的差异(李润等， 一种分离纯化透明质酸的新 离子交换剂，待发表) 。选择氯化钠为洗脱剂，对 HA 粗品进行离子交换层析。本文就洗脱剂的流速、浓度、pH 等条件对分离、 纯化 HA 的影响进行了研究。层析分离结果表明，HA 精品纯度高,分子量大,能 满足HA 注射剂原料中小量制备的要求。 1 剂与仪器 HA 粗品和对照品( 山东正大福瑞达制药有限公司提供) ；葡糖醛酸对照品、 牛血清白蛋白对照品为生化试剂。 离子交换柱(250 ×10mm) ；紫外检测仪(Hitachi Instruments Inc) ；蠕动泵(东 方科学仪器厂) ；自动部分收集器(上海东风电讯仪器厂) ；红外吸收光谱仪(Perkin Elmer 783) ；紫外吸收光谱仪(岛津UV-210A) 。 2 实验方法 2.1 层析分离纯化 经预处理的强酸 阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别 装入250mm ×10mm 的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长径比为20 ∶1，将 两柱串联。在常温下依次操作： 加样：用移液管量取HA 粗品溶液，从交换柱顶部加入。 洗脱：用蠕动泵连续加入氯化钠溶液洗脱。 部分收集：用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。 PDF created with pdfFactory trial version 检测：洗脱流出液连续通过紫外检测仪，在选定波长下测定其吸光度A，并 自动绘制洗脱曲线。HA、蛋白质、核酸的检测波长分别为205nm、280nm 、260nm 。 洗脱流出液经沉淀、干燥，得到HA 精品。然后分别测定其葡糖醛酸和蛋白 [3] 质含量、HA 分子量，并测定红外与紫外吸收光谱图 。 2.2 测试方法 葡糖醛酸含量测定：参照Bitter-Muit 的咔唑法测定，与葡糖醛酸对照品对照。 蛋白质含量测定：参照Lowry 法测定，与牛血清白蛋白对照品对照。 黏度及分子量的测定：参照Shimada 法，采用乌氏粘度计。参比液为pH7.3 的0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，测定温度28 ±0.05 ℃，三点外推至比浓度为0，求出 特性黏数[ η]，并计算出分子量。 红外吸收光谱(KBr 压片) ：分辨率为2.4cm-1 ，在4000cm-1～400cm-1 范围扫 描。 紫外吸收光谱：扫描范围190nm,～300nm,扫描速度为100nm/min 。 3 结果与讨论