版药典药品微生物限度检查法.ppt

沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表 平板 沙门菌属亚属ⅠⅡⅣⅤ 沙门菌亚属Ⅲ 胆盐硫乳琼脂(DHL) 无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色 发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属ⅠⅡⅣⅤ同 沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S) 无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心 同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别 曙红亚甲蓝琼脂(EMB) 无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑 发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同 麦康凯琼脂(MacC) 同曙红亚甲蓝琼脂平板 发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同 菌落特征补充 由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显 在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心 在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别 阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查 由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别 菌落传纯 从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养24±2h，观察结果 三糖铁琼脂反应 疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应 ①斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)； ②斜面红色，底层黄色； ③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。 多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。 对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。 疑似沙门菌，应取三糖铁琼脂斜面得培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验确认是否为沙门菌。 三、铜绿假单胞菌检查法  对照用菌液 铜绿假单胞菌〔CMCC (B) 10104〕 营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌加入量含50～100个cfu (一般用量为0.1ml)，菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定 增菌培养 取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入1：10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml)，其中一瓶加入含对照菌50～100个菌落形成单位的菌液作为阳性对照。第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照 36±1℃培养18～24h(必要时可延至48h) 分离培养 增菌培养液1～2环 (如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板 于36±1℃培养18～24h 铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选 当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。当阳性对照平板无菌落生长或生长菌落经检查不是铜绿假单胞菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响 纯培养 供试品分离平板生长上述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查 初步鉴别试验 革兰染色镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列 氧化酶试验：铜绿假单胞菌呈阳性 绿脓菌素试验:铜绿假单胞菌呈阳性 结果报告 供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌 供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓