硫酸铵纯化抗体.pdf

1.兔抗人IgG抗体的初步纯化

(硫酸铵沉淀法）

一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯

化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫

球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋

白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，

使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用

不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小

和不易使蛋白质变性而应用最广。

二、试剂及仪器1.组织培养上清液、血清样品或腹水等2.硫

酸铵(NH)SO3.饱和硫酸铵溶液4.蒸馏水5.PBS(含0.2g

424

/L叠氮钠)6.透析袋7.超速离心机8.pH计9.磁力搅拌

器

三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉

淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。

通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。

（一）配制饱和硫酸铵溶液1.将767g(NH)SO边搅拌边慢慢加

424

到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为

100%的硫酸铵溶液(SAS)（4.1mol/L,25°C）.

（二）沉淀1.样品（如腹水）20000′g离心30mi，除去细

胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的

SAS到上清液中，终浓度为1：1。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅

拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析1.蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。

弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠

氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48

小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫

酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

四，应用提示

（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1.

边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1

(v/v)；2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜

（4°C）；3.3000′g离心30min（4°C），保

留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到

沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；4.上清

液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀

溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5.杂蛋白与欲纯化蛋

白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是

非常有效

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法

与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。

纯化产物的鉴定：

（1）效价测定:采用间接ELISA法(3mg/L抗原包被,1∶1

000开始倍比稀释)检测抗体的效价。

（2）Ig亚类(型)的鉴定:用小鼠Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交

瘤细胞培养上清中mAb的类和亚类。

（3）westernblot鉴定抗体特异性:取5μg人IgG经

SDS后,转移至硝酸纤维素膜上,用50g/L脱脂奶粉室温

封闭1。依次滴加封闭液稀释的5mg/L纯化抗体(室温孵育2

或4℃过夜,洗膜3次)及1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠Ig

G(室温孵育1h,