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分光光度测量方法 第一页，共十五页，2022年，8月28日 一、普通分光光度法 1.单组分的测定 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 2.多组分的同时测定 ⑴ 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。 ⑵ 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb 第二页，共十五页，2022年，8月28日 二、示差分光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs cx)。则： Ax= εb cx As = εb cs ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。 第三页，共十五页，2022年，8月28日 示差分光光度法（示差法） ΔA＝Ax －As =εb(cx － cs ）=εbΔc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔA 。 示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ： cx = cs + Δc 第四页，共十五页，2022年，8月28日 示差法标尺扩展原理： 普通法： cs的T=10%；cx的T=5% 示差法： cs 做参比，调T=100% 则： cx的T=50% ；标尺扩展10倍 第五页，共十五页，2022年，8月28日 三、双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 ΔA ＝Aλ2 －Aλ1 ＝ (ελ2 －ελ1)b c 两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。 第六页，共十五页，2022年，8月28日 关键问题: 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例： 设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为: ΔAx和ΔAy，则该体系的总吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y = ΔA x + ΔA y 如何选择波长λ1 、λ2有一定的要求。 第七页，共十五页，2022年，8月28日 选择波长组合λ1 、λ2的基本要求是： ⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即： ΔAy = ΔA yλ2 － ΔA yλ1 = 0 故： ΔAx+y = ΔA x=(εxλ2－εxλ1)bcx 此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。 可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。 ⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。 第八页，共十五页，2022年，8月28日 四、导数分光光度法 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析： Ｉ＝Ｉ0 e-εbc 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定： dI 0 /dλ＝0 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ 第九页，共十五页，2022年，8月28日 导数分光光度法 dI/dλ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系； 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率dε/dλ。吸收曲线的拐点处dε/dλ最大，故其灵敏度最高(见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略） 第十页，共十五页，2022年，8月28日 请选择内容： 第一节 基本原理 第二节 紫外-可见分光光度计 第三节 显色与测量条件的选择 第四节 分