黄芪皂苷骨架形成酶基因克隆及功能分析.pdf

中文摘要

选题依据：黄芪中含有丰富的皂苷类物质，其在器官保护和免疫调节等方面药理

活性显著。在植物中，黄芪皂苷的生物合成前体物质C30骨架是由关键酶法尼基焦磷

酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPS）、鲨烯合酶（squalenesynthase，SS）和

鲨烯环氧酶（squaleneepoxidase，SE）催化经由甲羟戊酸途径（Mevalonatepathway，

MVA）和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径（2-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）

合成的两种C5前体异戊烯基焦磷酸（Isopentenylpyrophosphate，IPP）及其异构体二

甲基烯丙基焦磷酸盐（Dimethylallyldiphosphate，DMAPP），经过缩合、环化等一系

列反应形成的。为全面阐明黄芪皂苷生物合成途径，以构建异源合成的微生物工厂，

实现绿色高效获取黄芪皂苷，加强药物特异性修饰，本研究致力于对黄芪皂苷骨架形

成的关键酶FPS、SS和SE进行基因克隆与功能分析，为后续工作奠定研究基础。

目的：基于酿酒酵母系统阐明黄芪皂苷骨架合成相关酶FPS、SS和SE的功能。

方法：

1、利用NCBI数据库结合蒙古黄芪转录组数据库，对皂苷骨架合成关键酶进行

序列筛选。并通过生物信息学手段对筛选到的序列进行相关理化性质分析，例如保守

结构域分析等，预测基因功能。并构建基因系统发育树。

2、对蒙古黄芪幼苗根、茎、叶分别进行RNA和黄芪甲苷提取，分别进行靶标

基因表达量测定和黄芪甲苷含量测定。将靶标基因的组织特异性表达和黄芪甲苷组

织特异性分布数据进行相关性分析，进一步预测基因功能。

3、构建靶标基因过表达载体，并转化到酿酒酵母W303a进行蛋白表达，使用

Westernblot鉴定是否有目的蛋白表达。

4、基于酿酒酵母中天然存在的萜类物质前体供应途径，通过GC-MS检测目标

代谢产物角鲨烯和环阿屯醇含量的变化来分析基因功能。

结果：

1、克隆了四条黄芪皂苷骨架形成关键酶基因，分别为AmFPS、AmSS、AmSE-

1和AmSE-2。生物信息学分析结果显示，AmSS、AmSE-1和AmSE-2均可能存在跨

膜结构域，亚细胞定位预测定位于质膜上。四条基因中均存在相关基因特征的保守结

构域。系统发育结果显示，豆科植物FPS、SS序列同源性较高，而不同物种间SE基

因序列差异较大。

I

2、黄芪甲苷HPLC-ELSD结果显示，5-6周龄蒙古黄芪幼苗中的黄芪甲苷在根

中积累量较高，叶次之，茎中几乎没有。荧光定量结果显示四条靶标基因均在根中有

显著性高表达，叶和茎次之，相关性结果显示，四条靶标基因表达量与黄芪甲苷积累

量均呈现正相关。

3、GC-MS检测结果显示，相较于空白和空载菌株，AmFPS和AmSS均能显著

提高酿酒酵母中角鲨烯的含量，且AmSS提高能力更强。而AmSE-1和AmSE-2均

能提高含有黄芪环阿屯醇合成酶（Cycloartenol，CAS）的重组酿酒酵母（（W303a-CAS）

下游通路中环阿屯醇的含量，但两者提高能力没有显著性差异。

结论：本研究克隆了四个蒙古黄芪皂苷骨架形成关键酶基因AmFPS、AmSS、

AmSE-1和AmSE-2，功能分析结果显示，四个关键酶参与根中黄芪皂苷的骨架形成，

并且能够在酿酒酵母中发挥催化功能，分别显著提升关键前体物质角鲨烯和环阿屯

醇的含量。

关键词：黄芪皂苷骨架生物合成；法尼基焦磷酸合酶；鲨烯合酶；鲨烯环氧酶；

气相色谱质谱法

II

ABSTRACT

Basisforselectionofthetopic:Astragalusmembranaceusisrichinsaponins,which

havesignificantpharmacologicalactivitiesino