动物尿样中红霉素ELISA检测操作规程.doc

动物尿样中红霉素ELISA检测操作规程

1．试剂和样品准备

1.1复溶工作液

用蒸馏水或去离子水将2×复溶液按1：1体积进行稀释（30ml复溶液加30ml蒸馏水或去离子水）。

1.2洗涤工作液

用蒸馏水或去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积进行稀释（30ml浓缩洗涤液加570ml蒸馏水或去离子水）。

1.3样品前处理

取100μl新鲜尿样，加入900μl复溶工作液，混匀，待检测用。

2．操作步骤

注意：所有试剂在使用前一律恢复至室温（20～25℃）。试剂应该旋转或颠倒混匀。使用后所有试剂立即放入2-8℃存放。

2.1取出抗原包被板，在记录纸（表）上记录样品位置，每个样品盒标准品做2孔平行。

2.2加标准品/样品50μl/孔，随即加入酶标记二抗50μl/孔，再加入抗体工作液50μl/孔，轻弹微量反应板或用振荡器震荡，将反应板中的溶液混匀。

2.3用封条封住反应板，在37℃避光孵育40min。

2.4每孔用大约300μl稀释好的洗液洗涤微孔4～5次（每次间隔10s）。最后一次洗涤后，在吸水材料上轻扣反应板，彻底去掉剩余的液体。

2.5显色：每孔加50μl底物液A，再加50μl底物液B，轻微振荡混匀。

2.637℃避光孵育15min。

2.7每孔加入500μl终止液，轻微振荡混匀，终止反应。

2.8在450nm处测量并记录，样品和所有对照的吸光值。也可用双波长（450nm和650nm）测定。

2.9计算结果

3．定量计算方法

3.1百分吸光率的计算

标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的吸光值的平均值，再乘以100%，即：

百分吸光率（%）=B/B0×100%

其中B：标准品或样品的吸光值的平均值

B0：0ppb标准品吸光值的平均值

3.2标准曲线的绘制

以标准品百分吸光率为纵坐标，以红霉素标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线。

3.3样品浓度的计算

将样品的百分吸光率带入标准曲线中，计算出样品所对应的浓度，再乘以样品对应的稀释倍数即为样品中红霉素的实际浓度。

样品的稀释倍数：10

定量检测限：2ppb