细胞增殖和活力.ppt

注意事项-时间点的设定在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。第20页,共23页，星期六，2024年，5月注意事项-培养时间200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。?第21页,共23页，星期六，2024年，5月注意事项MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。第22页,共23页，星期六，2024年，5月注意事项-避免血清干扰用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。?第23页,共23页，星期六，2024年，5月关于细胞增殖和活力*检测细胞增殖能力的方法一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。一种是间接的方法，即细胞活力（cellviability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。第2页,共23页，星期六，2024年，5月细胞增殖检测技术直接计数胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)渗入法5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法CCK8MTT检测法ATP检测第3页,共23页，星期六，2024年，5月1.直接计数利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对数目进行比较。优点：简单：不需要特定的试剂和仪器准确缺点：不适合样品数量多的情况不适合评估特定的亚群第4页,共23页，星期六，2024年，5月台盼蓝细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。第5页,共23页，星期六，2024年，5月2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞DNA链内标记核苷酸的量的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。第6页,共23页，星期六，2024年，5月3.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实验，缺点：就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题第7页,共23页，星期六，2024年，5月*4.5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。第8页,共23页，星期六，2024年，5月5.羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐