抗肿瘤药物的筛选方法.ppt

法尼基转移酶（Ras）抑制剂筛选Ras蛋白是调节细胞生长和增殖的信号通路的重要元件,是控制外来分子信号的分子开关。Ras蛋白以GDP结合和GTP结合两种形式存在。第95页,共105页，2024年2月25日，星期天原理：(pulldownassay)活化形式的GTP-Ras与下游的效应蛋白Raf（Raf有Ras-bindingdomain，Raf-RBD）结合。Raf-RBD-GST融合蛋白固化谷胱甘肽亲和树脂（GSH），与含有GTP-Ras的样品孵育，Raf-RBD与GTP-Ras充分结合，洗脱后，经免疫印迹检测Ras的表达量。GSHresinGSTRaf-RBDGTP-RasAnti-Rasantibody第96页,共105页，2024年2月25日，星期天丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选丝裂原活化蛋白激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将细胞外刺激信号传导到细胞核内，并引起细胞的生物学反应，如增殖、凋亡、分化等。主要有三条信号通路：ERK（Extracellularsignalregulatedkinase），JNK(c-JunN-terminalkinase)和p38。第97页,共105页，2024年2月25日，星期天原理：生物大分子相互作用分析（Biacore）Biacore系统以无标记的检测方式来实时监测分子间的相互作用，可观察两种分子结合的特异性，能检测到两种分子的结合能力，了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。第98页,共105页，2024年2月25日，星期天实验方法：先将多种生物分子（MAPK酶等）固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化第99页,共105页，2024年2月25日，星期天小结动物水平筛选腹水瘤，S-180肉瘤，人癌裸鼠移植模型细胞水平筛选抗肿瘤增殖（MTT法，SRB法，排染试验)分化诱导剂（NBT还原法）调亡诱导剂（Hoeschst，ＤＮＡ梯带，Annexin-V/PI）血管生成抑制剂（人血管内皮细胞，鸡胚尿囊，斑马鱼）耐药性逆转剂（Ｐ－ｇｐ抑制剂）肿瘤侵袭和转移抑制剂（Transwell）自噬诱导剂（TEM，LC3，MDC）第100页,共105页，2024年2月25日，星期天酶水平筛选ＤＮＡ拓扑异构酶抑制剂筛选端粒酶酶抑制剂筛选VEGFR酪氨酸蛋白激酶酶抑制剂筛选(ELISA)组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选基质金属蛋白酶抑制剂筛选(FRET)法基尼转移酶抑制剂筛选(Pulldownassay)丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选(Biacore)第101页,共105页，2024年2月25日，星期天展望抗肿瘤药物正从传统的细胞毒性药物,向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。新技术的发展特别是微阵列技术、生物芯片技术、蛋白组技术、生物信息技术、组合化学等的应用将使新靶点的识别、新的活性化合物的筛选走向微量化、自动化、简单化。第102页,共105页，2024年2月25日，星期天第103页,共105页，2024年2月25日，星期天第104页,共105页，2024年2月25日，星期天*感谢大家观看第105页,共105页，2024年2月25日，星期天6.抗肿瘤侵袭和迁移实验转移是恶性肿瘤的重要特征肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，Liotta等提出肿瘤侵袭和转移的三步学说，即粘附、降解和移动。粘附是肿瘤细胞侵袭的起始，肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原等相粘连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，降解细胞外基质肿瘤细胞一旦突破基底膜，逃避免疫监视，即在基质内较快侵