大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范.doc

ICS FORMTEXT FORMTEXT 点击此处添加中国标准文献分类号 FORMTEXT FORMTEXT SN 中华人民共和国 FORMTEXT 出入境检验检疫行业标准 FORMTEXT SN/T FORMTEXT 2124— FORMTEXT 2012 FORMTEXT FORMTEXT 大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范 FORMTEXT Protocol of quarantine for Gyrodactylus salaris of Atlantic salmon FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 SN/T 2124—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT I 前言 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）编写的水生动物疾病诊断手册（2011版）中2.3.03 Gyrodactylosis（Gyrodactylus salaris）的有 本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C和附录D为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、王彩霞、刘荭、岳志芹、贾广乐、刘建、张永宁、张旻、吕继洲。 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准为修订出入境检验检疫行业标准“大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范”（SN/T 2124-2008）。 大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范 范围 本标准规定了三代虫检疫时的样品采集、形态学检查、聚合酶链反应（PCR）初筛以及大西洋鲑鱼三代虫特异的PCR检测方法。 本标准适用于大西洋鲑鱼三代虫的口岸检测、监测以及养殖场流行病学调查。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 鲑鱼三代虫 Gyrodactylus salaris 鲑鱼三代虫隶属于单殖亚纲三代虫科，主要感染2龄以内野生和养殖鲑鱼。它还能感染其它的鲑鳟鱼类，如虹鳟、北极红点鲑、溪红点鲑、鮰鱼、湖红点鲑和鳟鱼（按易感性从强到弱排列）。 概述 大西洋鲑鱼三代虫简介参见附录A。 材料 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T 6682中一级水的要求。 苦味酸铵—甘油（APG）溶液：配制方法见附录B.1。 裂解液：配制方法见附录B.2。 引物：浓度为10pmol/L，其序列如下： 通用PCR引物： ITS-up：5’-TTTCCGTAGGTGAACCT-3’ ITS-lp：5’-TCCTCCGCTTAGTGATA-3’ 扩增三代虫内部转录间隔区（ITS）中1300bp的片段，退火温度为55℃ 特异PCR引物： CO1-up：5’-TAATCGGCGGGTTCGGTAA-3’ CO1-lp：5’-GAACCATGTATCGTGTAGCA-3’ 扩增大西洋鲑鱼三代虫细胞色素氧化酶I（CO1）中893bp的片段，退火温度为50℃。 PCR buffer、dNTP（2.5mmol/L或10mmol/L）、DNA聚合酶、DNA Marker、电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。 电泳缓冲液：配制方法见附录B.3。 无水乙醇 琼脂糖 设备 超净台 解剖镜 生物显微镜 通风操作台 PCR仪 电泳仪 凝胶成像仪或紫外透射仪 -20℃冰箱、4 高速冷冻离心机 高压灭菌锅 微量移液器及配套的吸头 检测方法 采样及固定 在实验室中检查三代虫时，必须采集活鱼并放在原生活的水中运输，且一个容器只装运一种鱼。在冰中运输的死鱼不适于作三代虫的检查。 不能进行活鱼检查时，可以用甲醛固定鱼或用酒精处理鱼后进行检查。采用甲醛固定鱼时，放入鱼之前甲醛的浓度应在8%~10%（相当于20%~25%的福尔马林），因为固定过程中有水从鱼体中释放出来，因此固定鱼后甲醛的浓度应不低于4%（相当于10%的福尔马林）。采用酒精处理鱼时，建议酒精的浓度在80%~85%之间为宜，处理鱼后酒精的浓度应保持在大约70%。固定鱼的标本瓶应相对