EPO糖基化类型及作用.ppt

EPO糖基化类型及作用 韩云波 王佳彬 70k生命基地 沈阳药科大学 主要内容 （一）EPO的简介 （二）N-糖基化 （三）唾液酸对活性的影响 （四）新型EPO （一）EPO 简介[3] 人类 EPO 含有 166 个氨基酸 ,相对分子质量为 34 400 ,有 4 个糖基化位点 ,其中 3 个 N-糖基化位点(Asn24 ,38 ,83) 和 1 个 O -糖基化位点 (Ser126) ,并有2 个二硫键连接。其中 60 %是蛋白质 (单个多肽链) , 40 %为糖类。 糖基化对稳定 EPO 的体内活性具有重要作用 ,若缺乏糖链 ,则 EPO 在体内迅速被水解而失活，而在体外增强 。 r HuEPO 的一级结构、Glu-C 酶解片段[5] EPO 简介[3] 　　天然存在的 EPO 分为两种类型 , α型含 34 %的碳水化合物 ,β型含 26 %的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。 EPO简介[２] 　近年来研究显示，仅能进行N-连接而不能进行O-连接的糖类对EPO功能的产生具有重要意义. （二）EPO 的N -糖基化 研究表明 , EPO的 N -糖基化程度对 EPO 的体内活性有相当大的影响。N -糖基化不完全的 rhEPO体外活性正常 ,而体内活性则降低到体外活性的1/500 ,其体内被清除的速率也明显降低[9]。EPO属于内源性物质 ,正常人体液中含量很低 ,半衰期短。 rhEPO 与内源性 EPO的氨基酸序列完全相同 ,仅糖基部分有微小的差别 [10]。rhEPO 比天然 EPO 含有更多的三天线及四天线低聚糖 ,并且二者在唾液酸化程度上有明显的差别[11,12] 。 rhEPO糖基化性质与 rhEPO的生物学功能关系密切 ,且是内源性 EPO与外源性 EPO的区别所在。 　r HuEPO 中氮连接寡糖的结构和类型 氮连接寡糖分为 3 种类型 ,即高甘露糖型、杂种型和复杂型。rHuEPO 中氮连接寡糖为复杂型寡糖。该类型寡糖在组成上可分为糖核部分、天线部分及末端唾液酸部分。其中糖核部分是固定不变的 ,而天线部分可为二天线、三天线、四天线 ,最多只能为四天线 ,天线的组成为乙酰氨基乳糖 ,且可增加一个乙酰氨基乳糖单元 ,末端为唾液酸 ,唾液酸较易脱落。EPO 中的四天线寡糖是氮连接寡糖中分子量比较大的。 　r HuEPO 中氮连接寡糖的结构和类型 　　通过 MALDI/ TOF MS 分析各个位点的寡糖肽 ,表明二天线寡糖主要在 24 位点上 ,38 和 83 位点主要以多天线为主。 　　国产 EPO 的寡糖唾液酸乙酰化的程度高 ,大部分寡糖的唾液酸都被乙酰化了，多天线唾液酸乙酰化有助于 EPO 在体内的抗酶解 ,降低代谢速率 ,提高生物活性。 　　 3个氮连接寡糖位点的微不均一性 利用糖肽中肽段的辅助离子化作用 ,将唾液酸和寡糖作为一个整体分析。将国产 rHuEPO 用 Glu-C 酶解 ,HPLC分离 ,ESI－MS 在线监测含糖位点 ,并用在线 ESI－MS 分析83 和 38 位点氮连接寡糖的微不均一性 , MALDI/ TOF MS 分析了3 个糖基化位点的寡糖的微不均一性。 （三）唾液酸含量对其体内生物学活性的影响[8] EPO 分子中糖含量与其体内生物学活性相关早 有报道[6] 。正常 EPO 分子内唾液酸含量约 10mol/ molEPO[7] 。唾液酸存在于糖链的末端 ,有报道指出 分子中唾液酸含量低的 EPO 分子 ,糖链末端的裸露 的半乳糖残基容易被肝细胞上的受体所识别 ,从而 被肝细胞吸收分解 ,降低了体内的生物半衰期 ,是其 体内生物学活性低的原因[7] 。 唾液酸含量对其体内生物学活性的影响[8] 体内生物学活性低的EPO 的相对分子质量也较体内生物学活性高的 EPO的低。推测是由于 EPO 分子糖基化不完全 ,特别是高分枝的糖链结构少 ,有效唾液酸化的糖链末端少 ,因而生物学活性低。 还有研究表明：糖链以4条分枝为主(完全由唾液酸构成)的EPO，其活性相当于“标准”的EPO活性，而以2条分枝为主(完全由唾液酸构成)的EPO，其活性在体外3倍多于“标准”EPO，而在体内则仅为正常活性的15%。 糖基化与生物