激光扫描共焦显微镜技术.ppt

程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测 量。 ?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+浓度绝对测量1）单波长公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:细胞内无钙时的荧光强度(MnCl2)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）激光扫描共焦显微镜应用第31页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三细胞内生理Ca2+浓度值（10-8-10-7M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）2）标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA-Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度3）比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光扫描共焦显微镜应用第32页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜应用快速Ca2+变化的测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt)第33页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3+TMRM(线粒体荧光探针，红色）2.特异定位的重组水母发光蛋白水母发光蛋白与Ca2+结合后发蓝光用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测激光扫描共焦显微镜应用第34页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三关于激光扫描共焦显微镜技术第1页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术及应用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy第2页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术人眼分辨率： 0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm第3页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三二、原理激光扫描共焦显微镜技术第4页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三原理小结: Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦显微镜技术第5页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术第6页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术第7页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像第8页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片conventionalconfocal第9页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率

第10页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响

第11页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三激光扫描共焦显微镜技术三.激光扫描共焦显微镜的设计特点