间接免疫荧光检测.ppt

关于间接免疫荧光检测第1页，共12页，星期日，2025年，2月5日原理间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合，形成一个Ag-Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。第2页，共12页，星期日，2025年，2月5日外周血单个核细胞分离------葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法[原理]外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。第3页，共12页，星期日，2025年，2月5日[材料]1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.077±0.001g/L）2、2％台盼蓝染液3、Hank’s液或者RPMI-1640培养基4、试管、吸管、水平离心机等第4页，共12页，星期日，2025年，2月5日[方法]1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2mlHank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。第5页，共12页，星期日，2025年，2月5日第6页，共12页，星期日，2025年，2月5日4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2-5mlHank’s液的离心管中，混匀。5、室温下，1500rpm离心10min。第7页，共12页，星期日，2025年，2月5日6、弃上清，重复洗涤一次。用完全RPMI-16401ml定容，计数细胞，调整细胞浓度。一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。7、细胞活力检查取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。第8页，共12页，星期日，2025年，2月5日材料1.AgPBMC2.Ab1兔抗人白细胞血清(Ab1)3.Ab2FITC-抗兔单克隆抗体(Ab2)4.洗涤液5.荧光显微镜第9页，共12页，星期日，2025年，2月5日