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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对桃果实软化的作用机制研究 姓名：阚娟 学号： D07043 导师：梁建生教授、金昌海教授 摘要：本研究通过对桃果实不同时期α-L-阿拉伯糖苷酶（α-AF）ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因的表达情况分析，揭示桃果实软化阶段α-AF基因的表达与细胞壁半纤维素降解特性的关系，与ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因的表达之间的关系，以及外源乙烯和1-甲基环丙烯处理后对该基因和蛋白质表达的调控。从分子水平探明α-AF对桃果实软化的调控机制，为选育耐贮藏水蜜桃品种、制定桃果实的贮藏技术体系提供依据。 关键词：桃，软化，α-L-阿拉伯糖苷酶 1.研究意义 我国的桃品种繁多，分布甚广，鲜食桃柔软多汁，以鲜嫩富含浆液取胜。但我国许多地方特有的优质桃果实都极不耐贮藏，其中如无锡水蜜桃，该桃素以味甜质糯、皮薄汁多、酸甜适可备受人们青睐，但水蜜桃果实在常温下采后2～3α-L-阿拉伯糖苷酶(α-AF)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)等在果实成熟软化过程中的作用。 Hegde[2]等的研究结果提出，桃果肉细胞壁的中性糖中阿拉伯糖含量仅次于半乳糖醛酸，以支链形式与细胞壁多聚体成分共价连结。阿拉伯呋喃糖苷酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）是一种能够水解非还原性呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类与果实软化的关系的研究也引起了国外学者的重视α-AF在某些类果实，鳄梨[3]、番茄[4]、日本梨[5]、日本柿子[6]等的后熟软化过程中起重要作用。已有研究表明，乙烯在α-AF基因的表达过程中起着重要作用，可能伴随着基因编码与成熟相关的PG和β-GALⅡ[4]。在许多果实如梨、桃、油桃、草莓等成熟过程中，阿拉伯糖大量丧失，而且在鳄梨果实中检测到阿拉伯糖含量的显著变化。α-AF与桃果实软化阶段关系的研究，国内外是空白。 主要参考文献（略） 2、研究内容、研究目标以及拟解决的问题 研究内容： (1) 对不同成熟度、不同贮藏期以及不同处理的桃，分析果实硬度、可溶性固形物含量、乙烯释放量的变化。分析细胞壁果胶质、半纤维素、纤维素多糖类降解特性（重量的变化、多聚体分子量的变化和单糖类的解离特性）。阐明半纤维素多糖的增溶对果实软化的贡献，以及从单糖类的解离特性建立α-AF与果实软化的关系。 (2) 对不同时期的桃果实材料，分析α-AF基因的表达情况，探讨α-AF基因的表达与果实的软化以及细胞壁半纤维素降解特性之间的关系。阐明α-AF基因的表达与桃果实软化的关系。1-甲基环丙烯(1-MCP)处理桃果实，分析果实软化过程中α-AF活性变化以及α-AF、ACC合成酶和ACC氧化酶基因和蛋白质表达水平的变化，研究它们与果实内源乙烯积累的关系以及对α-AF基因和蛋白质表达的调节，阐明α-AF对果实软化的调控机制。 研究目标： 探明α-AF基因在果实软化过程中的表达模式 探明α-AF基因与果实内源乙烯积累和细胞壁多糖降解之间的关系 探明外源乙烯和1-MCP处理对α-AF基因和蛋白质表达的调节机制 拟解决的关键问题： (1) 乙烯作为成熟有关的激素参与果实的后熟软化。如何阻断果实采后初期乙烯与果实体内乙烯受体的正常结合，抑制乙烯所诱导的与果实后熟衰老相关的一系列生理生化反应。这一点是本研究为说明α-AF对桃果实软化调控机理的前提。 (2)桃果实组织总RNA的提取纯化和通过RT-PCR方法对该基因的克隆和测序以及该基因在不同时期的表达分析是从分子水平探明α-AF对桃果实软化调控机理的关键。 3. 拟采取的研究方法、步骤、技术路线及可行性分析 研究方法： 本实验方法主要包括三大方面内容：试验材料的处理方法、常规实验项目的分析方法和分子生物学分析方法。 1） 试验材料的处理方法 本实验使用1-MCP乙烯受体抑制剂阻断果实内源乙烯的生理效应 ⑴ 对照，在20℃密闭处理24 h；⑵20℃下用1-MCP 500nl/L密闭处理24 h。处理后的果实于20℃下贮藏0、2、4、6、8、10天后按照上述同样操作取果肉部分，用液氮处理后保存于-80℃超低温冰箱中供分析用μl/L、100μl/L和200μl/L）处理30 h后置于20℃、相对湿度大于95%条件下贮藏。每隔天取样测定硬度和乙烯释放量，然后果肉部分用液氮冷冻处理置于-80，供分析用。(1) 桃果实采后不同时期硬度的变化－使用GY-1型果实硬度计 (2) 桃果实采后不同时期乙烯释放量的变化－气相色谱 (3) 桃果实采后不同时期细胞壁多糖类的分子量分布动态及其单糖类的解离特性 细胞壁成分及其多糖类组分的提取： 参照Brett等、Jin等方法。 果胶多糖包括两种螯合剂－可溶性果胶质多糖CDTA(1)和CDTA(2)组分以及两种N2CO3－可溶性果胶多糖N2CO3 (1)和N2CO3 (2)；半纤维素多糖包括不同浓度KOH－可