细胞程序性死亡与衰老.ppt

8.常用检测细胞凋亡的染料：二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。第31页,共45页，2024年2月25日，星期天Humanembryoatday4morulacontaining23nucleilabelledwithDAPI(blue),includingsevenTUNEL-labelledcondensednuclei(pink,arrow)thatwereexcludedfromdevelopment(KateHardy1999).第32页,共45页，2024年2月25日，星期天第三节细胞凋亡的分子机理第33页,共45页，2024年2月25日，星期天一、凋亡相关的基因和蛋白与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基都参于对细胞凋亡的凋控。研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。第34页,共45页，2024年2月25日，星期天1．Caspase家族相当于线虫的ced-3，是引起凋亡的关键酶。特点：①酶活性依赖于cys残基的亲核性；②总是在asp之后切断底物，故名caspase（cysteineaspartate-specificprotease）。③亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基，组成的异四聚体。第35页,共45页，2024年2月25日，星期天Caspaseclassification（Zimmermann2001）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiator第36页,共45页，2024年2月25日，星期天2．Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），线虫的同源物为ced-4。作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1与cytc、ATP/dATP结合后，召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。第37页,共45页，2024年2月25日，星期天3.bcl-2基因家族含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4）。分两类：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变，导致cytc释放，引起凋亡。bcl-2相当于线虫的ced9。主要定位于线粒体膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。第38页,共45页，2024年2月25日，星期天Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）第39页,共45页，2024年2月25日，星期天4.Fasfas又称作APO-1，属TNF受体家族。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合激活caspase。第40页,共45页，2024年2月25日，星期天5．P53基因组的守护者。辐射诱导的DNA损伤可通过ATM激活p53，阻断细胞周期，并提高Fas的表达，诱导凋亡。6．Myc转录因子，生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之引起细胞凋亡。7.ATM是DNA损伤检验的重要蛋白激酶，能激活P53。第41页,共45页，2024年2月25日，星期天（二）Fas诱导的细胞凋亡Fas与配体结合发生三聚化，通过胞内的DD区（Deathdomain）与接头蛋白FADD的DD区结合。FADDN端通过DED区（deatheffectordomain）与Caspase-8前体结合，Caspase-8通过子剪接激活。第42页,共45页，2024年2月25日，星期天Caspase-8引起caspase级联反应，激活Caspase-3、6、7。Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。Caspase还可降解CAD（caspase-activatedDnase）的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核，在核小体连接部位降解DNA。第43页,共45页，2024年2月25日，星期天在一型细胞（typeI），如胸腺细胞中，caspase-8有足够的活性引起细胞凋亡，高表达Bcl-2