肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnS_SXK7的分离鉴定及其抗性菌的抗性机制研究.pdf

摘要

肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）是临床中常见的革兰氏阴性菌之一，可

引起呼吸道、泌尿道等感染，该菌广泛分布于自然界和人体呼吸道内。随着抗生素的

滥用，多重耐药肺炎克雷伯菌不断出现，其感染率不断上升，成为最主要的公共卫生

问题。

噬菌体是一种病毒，它具备特定的侵染和裂解细菌的能力，可用于各种微生物疾

病的防治，有广泛的应用潜力。噬菌体的应用过程中面临着细菌抗性的突变等挑战，

制约了其广泛应用。因此，明确细菌对噬菌体产生抗性的机制，是噬菌体治疗领域要

面对的重大科学与实践难题。

本研究以肺炎克雷伯菌SXK7为宿主菌，从医院未处理的污水中分离出一株新

的噬菌体，并命名为vB_KpnS_SXK7，并对其进行了深入的研究。经透射电镜观察，

噬菌体vB_KpnS_SXK7为一株长尾噬菌体，采用双层板法测得的最佳MOI值为10。

该噬菌体的潜伏期约为30min，其爆发量为270PFU/细胞。噬菌体vB_KpnS_SXK7

在40-60°C的温度范围内可以维持较高效价，达到80℃时失去活性。pH稳定性的

实验显示，噬菌体vB_KpnS_SXK7在pH5-12间均可保持良好的活性。裂解谱分析

显示，该噬菌体的裂解谱相对较窄。体外杀菌实验表明，该噬菌体在MOI为10时表

现出显著的抗菌活性。进一步用大蜡虫幼虫感染模型对噬菌体vB_KpnS_SXK7的体

内杀菌能力进行评估，结果显示，与感染组相比治疗组的生存率显著提高，说明噬菌

体vB_KpnS_SXK7具有良好的杀菌能力。

对噬菌体vB_KpnS_SXK7的基因组进行测序与分析显示，其基因组为环状双链

DNA，全长为49088bp，GC含量为51.06%，共包含79个开放阅读框（openreading

frames,ORFs），其中61个是正向编码，而其余的ORF则是负向编码。另外，在噬

菌体vB_KpnS_SXK7的基因组中，未发现溶源及毒力相关基因。通过深入的遗传学

研究，发现噬菌体vB_KpnS_SXK7与肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnS_VA之间有着密

切的进化关联。

后续成功地诱导出了一株对噬菌体vB_KpnS_SXK7产生抗性的肺炎克雷伯菌，

命名为SXK7-R11。SXK7-R11的菌落形态和生长趋势与SXK7无显著差异。考虑到

吸附是噬菌体侵入细菌的初始阶段，进一步对这两种菌对噬菌体的吸附率进行了测

定。结果显示SXK7的吸附效率可以达到90%，而SXK7-R11的吸附效率仅为65%

I

以下，两者之间存在显著的差异。因此，我们推测SXK7-R11对噬菌体vB_KpnS_SXK7

产生抗性可能与其吸附过程密切相关。对抗性株SXK7-R11进行重测序分析，结果

显示抗性菌SXK7-R11中wzm基因发生了突变，导致其无法正常表达。

为验证wzm基因的突变是否为导致SXK7-R11对噬菌体vB_KpnS_SXK7产生

抗性的原因，进一步构建了回补菌株，以检测恢复wzm基因的表达是否可使SXK7-

R11对噬菌体vB_KpnS_SXK7恢复敏感性。结果显示，wzm基因回补株对噬菌体

vB_KpnS_SXK7的抗性消失。此外，通过对吸附效率、荚膜粘度和葡萄糖醛酸的定

量分析，发现回补菌株的吸附能力显著提升，同时荚膜粘度和葡萄糖醛酸的含量也得

到了恢复，进一步证实了wzm在肺炎克雷伯菌SXK7与噬菌体vB_KpnS_SXK7吸附

过程中发挥了重要的作用。

综上，我们以肺炎克雷伯菌SXK7为宿主菌分离到一株新的肺炎克雷伯菌噬菌

体vB_KpnS_SXK7，对其进行了生物学特性分析、全基因组测序及体内外杀菌能力

评估，与此同时，我们诱导了一株能抵抗噬菌体vB_KpnS_SXK7的肺炎克雷伯菌

SXK7-R11，初步解析了抗性机制，为阐明肺炎克雷伯菌对噬菌体产生抗性的机制提

供理论依据。

关键词：肺炎克雷伯菌SXK7；噬菌体vB_KpnS_SXK7；大蜡螟感染模型；噬菌体抗

性菌SXK7-R11；吸附受体；wzm基因